30/11/12

Evolución del cava y champagne según diferentes
tipos de taponado
Albert Mas,1 Joan Puig,2 Nuria Lladó3 y Fernando Zamora1
(1) Facultad de Enología de Tarragona. Universitat Rovira i Virgili
(2) Instituto Catalán del Corcho. Palafrugell, Girona
(3) Centro del Corcho-LGAI. Palafrugell, Girona
El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia del tipo de taponado sobre la evolución de los vinos espumosos (cava y champagne). Con este propósito se desarrolló el protocolo indicado en la figura 1. Para ello, se preparó un conjunto de botellas de ambos tipos de vino espumoso taponadas con:
• Tapón de corcho aglomerado con doble disco de corcho natural
• Tapón de corcho aglomerado
• Tapón de plástico (polietileno)
• Tapón corona y obturador de plástico
Cada grupo experimental fue dividido en dos subgrupos, uno de los cuales fue mantenido en posición vertical y el otro en posición horizontal con el fin de estudiar la influencia de la posición de conservación de la botella en cada sistema de taponado. Las botellas se conservaron en una sala de crianza a la temperatura de 15±1oC.
A los 6, 12 y 24 meses se realizó la toma de muestra (cinco botellas) para su correspondiente análisis químico y sensorial.
Los análisis químicos que se realizaron fueron aquellos que previamente habían sido considerados como los mejores indicadores de la evolución de los vinos. Concretamente, se determinaron las concentraciones de acetaldehído y la intensidad del color amarillo (A 420 nm) como indicadores de la oxidación del vino, y la presión interna de las botellas como indicadora de la hermeticidad del sistema de taponado.
El análisis sensorial fue realizado por 10 expertos, que valoraban de 0 a 5 la intensidad de los atributos sensoriales que se presentan en la tabla 1. Simultáneamente se realizaron medidas de la fuerza de torsión, de extracción y de la recuperación diametral de los tapones.
Con el propósito de simplificar la exposición de los resultados, únicamente se presentan los correspondientes a los 24 meses de conservación, por ser en este punto donde se observan mayores diferencias entre los sistemas de taponado, si bien hay que señalar que las tendencias fueron ya observadas a los 6 meses de conservación.
En las figuras 2 y 3 se presentan los resultados correspondientes a la evolución del cava y del champagne, respectivamente. Ambos vinos espumosos presentaron un comportamiento similar, por lo que los resultados pueden ser analizados conjuntamente. En términos generales, se puede apreciar que el tapón de plástico y el tapón de corcho aglomerado presentan un peor comportamiento que el tapón de corcho aglomerado con doble disco de corcho natural y el tapón corona. Ello se constata en que presentan una mayor coloración amarilla, unos niveles de acetaldehído ligeramente superiores y una menor presión interna. No se observan diferencias significativas entre las botellas derechas y las botellas tumbadas, con la excepción del tapón de corcho aglomerado que presenta un comportamiento aún peor cuando la botella esta en posición vertical.
En cuanto a los parámetros sensoriales, únicamente se presentan aquellos aspectos que dan lugar a diferencias dignas de mención. Estos resultados confirman los obtenidos por análisis químico, ya que los degustadores encontraron una mayor coloración amarilla, una mayor oxidación olfativa y una menor efervescencia en los vinos espumosos taponados con tapón de plástico y con tapón de corcho aglomerado conservados en posición vertical. Los degustadores también detectaron una mayor presencia de olor/sabor enmohecido en los vinos taponados con tapón de corcho aglomerado.
Es necesario señalar que los degustadores detectaron la presencia de olor/sabor enmohecido en botellas taponadas con tapón de plástico y con cápsula metálica, lo que indica que el término olor/sabor de corcho es inapropiado. Por tanto proponemos la utilización del término olor/sabor enmohecido, ya que no presupone culpabilidad alguna si no que únicamente describe las características de una sensación.
Principales conclusiones
Por todo lo expuesto se puede concluir lo siguiente:
La intensidad del color amarillo (A 420 nm) y la concentración de acetaldehído se incrementan durante el proceso de conservación tanto en el cava como en el champagne. Simultáneamente se detecta una disminución de la presión interna de todas las botellas. Estas variaciones son especialmente significativas en el segundo año de conservación.
Los tapones de corcho aglomerado con doble disco de corcho natural y el tapón corona presentaron claramente un mejor comportamiento que los tapones de corcho aglomerado y los tapones de plástico. Básicamente se comprobó que ambos vinos espumosos presentaban niveles de acetaldehído superiores y presiones más bajas al estar taponados con tapones de corcho aglomerado y con tapón de plástico. A nivel sensorial los vinos espumosos taponados con tapón de corcho aglomerado y con tapón de plástico presentaban una mayor sensación de oxidación olfativa y una menor sensación de efervescencia.
No se observa una tendencia clara en cuanto a la posición de conservación de la botella, con la excepción del tapón de corcho aglomerado en que la botella derecha pierde presión algo más rápidamente que la conservada en posición horizontal. El análisis sensorial también indicó que las botellas taponadas con tapón de corcho aglomerado conservadas en posición vertical presentaban niveles de oxidación superiores.
La incidencia de sabor/olor enmohecido que se detectó en las botellas taponadas con tapón de corcho aglomerado es superior a la del resto de sistemas de taponado.
Las pruebas físicas de extracción y recuperación de los tapones fueron realmente poco indicadoras de la evolución sensorial o química de los vinos espumosos.
Agradecimiento
Agradecemos la colaboración de los miembros del panel de degustación: Sr. Josep Bujan, Dr. Joan M. Canals, Sr. Ezequiel García, Sr. Mariano García, Sra. Nadine Gublin, Sr. Adolf Heredia, Sr. Pascual Herrera, Dra. Montse Nadal, Sr. Felipe Nalda, Sr. Oriol Suberviola, Sr. Agustí Torelló, Sra. Pilar Urpí, Sra. Anna Velásquez y Sr. Ramón Ventura.


Tabla 1. ATRIBUTOS SENSORIALES utilizados en el panel de desgustadores

Atributos visuales
Intensidad del color amarillo
Intensidad del color verde
Transparencia
Corona
Burbujas

Atributos olfativos
Intensidad
Nitidez
Afrutado
Floral
Brut
Herbáceo
Oxidación
Químico
Acético/acetato de etilo
Alcohol
Olor de enmohecido

Atributos gustativos
Efervescencia
Intensidad
Permanencia
Posgusto
Dulce
Ácido
Amargante
Acético
Alcohol
Cuerpo
Graso
Oxidación
Sabor de enmohecido
El metabolismo microbiano en el binomio corcho-vino
E. Navascués, F. Calderón y J.A. Suárez 
Laboratorio de Enología. Departamento de Tecnología de Alimentos.
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos.
Universidad Politécnica de Madrid
El empleo del corcho como tapón se ha fechado en torno al siglo V, con el hallazgo de ánforas griegas tapadas con corcho. Será en los siglos XVII y XVIII donde adquiera un importante auge como consecuencia del empleo del vidrio para la conservación y crianza del vino. Hasta entonces las botellas se tapaban con cuñas de madera y trapos embebidos en aceite y lacrados o encerados después. La leyenda considera a Dom Perignon (1639-1715), fraile benedictino de la abadía de Hautvillers, como el padre del empleo moderno del corcho. Son los vinos de la Champaña francesa los primeros en utilizar tapones de corcho, procedente de Cataluña, especialmente Girona, lo que hizo que esta región fuese la iniciadora de la industria del corcho en el mundo. En el siglo XIX, la utilización del corcho se generaliza como tapón para botellas de vino y comienzan los primeros estudios químicos y físicos sobre sus propiedades.
Compuestos volátiles responsables del gusto a corcho en el vino
Se denomina gusto a corcho a la sensación producida por ciertos componentes volátiles de carácter contaminante aparecidos en el vino y que tienen su origen en el tapón de corcho. La naturaleza de la alteración del vino conocida como gusto a corcho/goût de bouchon, que revierte exclusivamente en las características sensoriales del producto, explica la variedad de compuestos químicos a los que se ha atribuido la alteración. Estos compuestos son muy diferentes entre sí en su estructura química, pero todos ellos son moléculas orgánicas volátiles y muy odoríferas, que en pequeñas concentraciones producen olores desagradables. Su estructura y la ausencia de precursores presuponen una vía microbiana en su generación.
En un principio, se propusieron como causa del defecto olfativo y gustativo gusto acorcho, los compuestos 1-octeno-3-ona, 1-octen-3-ol, 2-metil isoborneol (MIB). A medida que se han ido afinando las técnicas de detección y análisis de compuestos minoritarios en vinos, se han incluido estructuras aromáticas, como el guaiacol y ciertos derivados clorados. Concretamente el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) se ha identificado como la principal causa de gusto a corcho en vinos, junto con otros compuestos aromáticos clorados como el 2,3,4,6-tatracloroanisol (TeCA).
Producción microbiana de compuestos organoclorados
El corcho constituye un sustrato adecuado para gran número de microorganismos y su presencia en tapones podría ocasionar alteraciones olfativas en el vino embotellado. Los microorganismos asociados con el gusto a corcho son, en su mayoría, hongos filamentosos, pero también levaduras y bacterias han sido implicadas en la alteración. Una vía de formación de cloroanisoles es la metilación de los clorofenoles (figura 1) correspondientes, reacción bioquímica que es efectuada por gran número de microorganismos. Sin embargo, aún no están perfectamente dilucidadas las condiciones en que se produce dicha metabolización, a partir de qué sustratos o materiales de uso en bodega y en qué momentos del proceso enotécnico.
Microorganismos asociados al gusto a corcho
• Microorganismos en planchas de corcho y procesado. La microbiota del corcho está constituida por gran variedad de hongos filamentosos, levaduras y bacterias. Las diferentes especies se encuentran de forma latente en las lenticelas, desarrollándose en la superficie del tejido cortical cuando las condiciones son las adecuadas.
Aspergillus glaucus forma parte de estos microorganismos con baja actividad en agua (aw), siendo frecuente en frutos secos, confituras y cereales. Diversos análisis micológicos han encontrado en las planchas de corcho los géneros Mucor, Penicillium, Trichoderma, y Cladosporium; otros describen estos géneros en el corcho en plancha, si bien la ausencia de Aspergillus en todos los aislamientos está en contradicción con otros estudios previos, como los de Moreau (1976, 1978) y Lefebvre et al. (1983).
• Microorganismos en tapones nuevos. La contaminación suele ser posterior al tratamiento del corcho, y normalmente tiene lugar en los locales de vinificación, dependiendo de las condiciones de almacenamiento de la bodega. Algunos estudios encuentran en bodega un Penicillium dominante (P. frecuentans) y dosAspergillus (A. nidulans y A. ruber). Otros, también sobre tapones nuevos, identifican varias especies de Penicillium (P. frecuentans mayoritariamente), así como P. multicolor y Asymetrica velutina. Las levaduras aisladas en ese mismo trabajo pertenecen a los géneros Candida y Saccharomyces.
• Microorganismos sobre tapones de vino embotellado. Se identifican tres géneros de mohos diferentes bajo la cápsula de tapones de botellas de vino congusto a corcho, Aspergillus (A. nidulans y A. glaucus en mayor proporción y A. fumigatus en porcentaje inferior), Penicillium (P. frecuentans, P. expansun) yCladosporium cladosporoides. En otro test se identifican Aspergillus nidulans yPenicillium frecuentans bajo la cápsula de tapones de Champagne. En cuanto a otros grupos microbianos, algunos estudios describen Rhodotorula y Candida.
• Microorganismos en madera de roble. La madera de roble es el material utilizado para la fabricación de barricas y botas destinados a la cría y envejecimiento del
vino. Antes de ser transformada en duelas se seca al aire durante un período de tiempo variable, no inferior al año. Durante esa etapa en la que sufre las inclemencias meteorológicas, se modifica su composición química y es colonizada por numerosos microorganismos. Algunos trabajos sobre la naturaleza y evolución de la microflora presente en la madera de roble en el transcurso del secado y envejecimiento han identificado 27 especies de mohos y 4 especies bacterianas, localizadas preferentemente en las capas superficiales de la madera, ya que la deshidratación rápida de la misma limita considerablemente el desarrollo e invasión en profundidad.
Las principales especies encontradas son los zigomicetos Rhizopus y Mucor,ascomicetos Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Cladosporium, Epicoecum, Hormonema, Penicillium y Trichoderma, así como dos géneros de levaduras, Candiday Rhodotorula. Entre las bacterias siempre se ha identificado el género Bacillus, y a veces Streptomyces, en la superficie de las duelas de más de tres años. La madera joven presenta una microflora esencialmente compuesta por Penicillium, Trichoderma, Aureobaidium y Bacillus. A los 10 años, la especie dominante esPenicillium roqueforti.
Mecanismos posibles de contaminación del vino
A continuación se recogen distintas hipótesis de contaminación del vino por compuestos organoclorados mediadas por microorganismos:
• El crecimiento microbiano en el corcho produce metabolitos, que pasan al vino modificando su calidad. Este crecimiento generalmente sucede antes de que el corcho se inserte en la botella pero puede ocurrir después de la inserción. Presumiblemente, constituyentes del corcho o sustancias usadas en el procesado del corcho (desinfectantes, por ejemplo) son, pero los mecanismos bioquímicos de estas reacciones son todavía desconocidos. Tampoco se ha encontrado la producción de un determinado compuesto responsable del gusto a corcho con la actividad de una especie microbiana en particular. Los hongos filamentosos parecen ser los principales responsables según la bibliografía consultada,  pero las actividades de levaduras de los géneros Rhodotorula y Candida y Strptomycesspp. también han sido implicadas.
• La segunda hipótesis establece la posibilidad de que los tapones de corcho introdujeran células viables en el vino y el crecimiento de éstas pudieran desarrollar la anomalía. Los hongos filamentosos no son capaces de sobrevivir y crecer en las condiciones del vino embotellado. Lee et al. anotan el crecimiento en vino de especies del género Bacillus aisladas en corchos. La incidencia de este crecimiento en el desarrollo del gusto a corcho no es conocida.
• Corcho como transmisor, pero no agente causante. No hay que olvidar que no siempre es el corcho el responsable directo del defecto organoléptico de los vinos, sino que puede servir de mero transmisor de las sustancias generadas vía microbiana en otros lugares del almacén o bodega, y que a través del ambiente llegan al corcho y de éste al vino.
En otras circunstancias, el vino podría estar afectado por compuestos organoclorados sin existir contacto con el tapón de corcho. Sería el caso de vendimias húmedas, afectadas por una importante proliferación de hongos, uso de fungicidas en la viña o utilización de placas de filtración u otros materiales almacenados en atmósferas contaminadas y luego aplicadas al vino (bentonita). En estos casos, no serían botellas concretas las afectadas, sino toda una partida del vino de la bodega la que presentaría el problema. Una alteración de este tipo sería ajena al tapón de corcho, pero sus resultados serían organolépticamente equiparables al gusto a corcho.
Conclusiones
Los resultados obtenidos por nuestro grupo de trabajo diferencian dos tipos de contaminaciones por organoclorados. En un grupo aparecen asociadas al 2,4,6 tricloroanisol (TCA) y en otro se relacionan con los distintos compuestos organoclorados en su conjunto. Dentro de este grupo se encuentran vinos sin embotellar, por lo que en estos casos no puede atribuirse al corcho la alteración buscada, al no haber tenido el vino contacto con el tapón.
La presencia microbiana en vinos, mayoritariamente constituida por levaduras, depende del tipo de elaboración y no está relacionada con el contenido en organoclorados en éstos o sus tapones. Se detectan hongos filamentosos en todos los tapones de corcho y su relación con los compuestos organoclorados no implica tanto al género o especie como al grado de invasión del tapón. La presencia de levaduras en los tapones no resulta significativa frente a la detección de la anomalía sensorial.
Tanto en el procesado industrial del tapón, como en las barricas de madera para la crianza se detectan moléculas cloradas susceptibles de ser metabolizadas por microorganismos, cuya presencia, además, se constata no sólo sobre estos sustratos sino en las propias bodegas con problemas de gusto a corcho.
Los ensayos realizados in vitro, muestran que las especies de hongos filamentosos aisladas de vinos y tapones metabolizan clorofenoles y biosintetizan clororanisoles en concentraciones importantes e intervalos de tiempo cortos, mientras que las levaduras son incapaces de llevar a cabo esta transformación. Las diferencias encontradas entre especies y cepas de mohos parecen correlacionarse con el grado de alteración (concentración de clorofenoles y clororanisoles) que presenta el vino o tapón del cual se aisló la cepa. Se demuestra además la producción de cloroanisoles a partir de otras moléculas portadoras de cloro (detergentes o fitosanitarios), lo que puede ser interpretado como posible mecanismo de defensa frente a la toxicidad de éstas.
Finalmente, es necesario resaltar que la alteración sensorial gusto a corcho/tapónno se asocia exclusivamente al tapón de corcho debiéndose, en sentido amplio, a la metabolización de moléculas cloradas por hongos filamentosos.
Bibliografía general
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Clasificación de vinos e identificación de defectos con un sistema de sensores de estado sólido

Clasificación de vinos e identificación de defectos
con un sistema de sensores de estado sólido
J.P. Santos, A.H. Cachero, J. Lozano , H. Vásquez, J.A. Agapito,
M.A. Martín y J. González
Departamento de Física Aplicada III (Electricidad y Electrónica),
Facultad de Ciencias Físicas de la Universidad Complutense de Madrid
Se ha diseñado un sistema flexible de propósito general para la clasificación de vinos e identificación de defectos aromáticos, causados principalmente por  ácido acético, acetato de etilo, compuestos relacionados con el corcho y compuestos sulfurosos orgánicos. Para ello se han usado sensores comerciales no específicos para los compuestos presentes en los vinos de prueba. Las respuestas de los sensores son muy diferenciadas, lo que permite la clasificación de vinos e identificación de líquidos con gran precisión. El sistema se puede modificar fácilmente para hacerlo portátil.
El sistema se compone de las siguientes partes: sensores y cámara, línea de gases y sistema de control y medida. Se han usado sensores semiconductores de óxido de estaño para gases. Estos sensores son de propósito general o específicos para gases inflamables o solventes. La electrónica ha sido desarrollada específicamente para esta aplicación. La línea de gases está compuesta por las botellas de gas, electroválvulas, caudalímetros másicos, humidificador y cámara de expansión. Se incorpora una red neuronal artificial para realizar la clasificación de los vinos e identificación de los defectos.
Se han realizado medidas sobre vinos procedentes de diferentes zonas y elaborados con distintas variedades de uva. Los vinos tintos medidos proceden de distintas regiones españolas: “Viña Roniel” de Ribera del Guadiana, “Señorío de Zocodover” de La Mancha, “Mas Elena” del Penedés y “Cune” de Rioja. Todos estos tintos jóvenes están elaborados con distintas variedades, principalmente tempranillo y cabernet sauvignon. Por otro lado, se han analizado también varios tipos de vinos de Jerez: fino, manzanilla, fino amontillado, oloroso seco, oloroso mediumcream y Pedro Ximenez.
Finalmente, los cuatro defectos aromáticos arriba citados se han probado en el vino de Rioja. Los resultados preliminares se muestran en las tablas 1, 2 y 3, que corresponden respectivamente al porcentaje de respuesta del sistema para el grupo de tintos, a los vinos de Jerez y al vino de Rioja (en este último se ilustra el porcentaje de respuesta respecto a cuatro defectos aromáticos concretos).
Tabla 1: Respuesta del sistema en  % para varios tintos jóvenes:
Clasificación
de la red
Vinos de prueba
Viña RonielS. ZocodoverMas ElenaCune
Viña Roniel98111
S. Zocodover19810
Mas Elena01961
Cune10298


Tabla 2: Respuesta del sistema en para los vinos de Jerez:

Clasificación
de la red
Vinos de prueba
Fino QuintaBailen
Oloroso
Coquinero fino amontillado10 RF oloroso médiumOsborne CreamPedro Ximenez 1827
Fino Quinta90312220
Bailen
Oloroso
27021021
Coquinero fino amontillado6285511
10 RF oloroso médium21507553
Osborne Cream01016808
Pedro Ximenez 182700021087
Tabla 3: Respuesta del sistema en para el Rioja con varios defectos aromáticos
Clasificación
de la red
Defectos
RiojaÁcido acéticoGuaiacolAcetato de etiloEtanoditiol
Rioja1005000
Ácido acético095010
Guaiacol0060300
Acetato de etilo0040681
Etanoditiol000199
Agradecimientos:
Los autores quieren agradecer a Osborne S.A. las muestras de vino de Jerez usadas en este trabajo.
El sistema se ha publicado o se ha enviado para su publicación a:
Santos, J.P., Cachero, A.H., Lozano, J., Vásquez, H.,
Agapito, J.A., Martín, M.A. y González, J.: «Wine identification with a solid state sensor array» (enviado a Thin Solid Films)
Santos, J.P., Cachero, A.H., Lozano, J., Vásquez, H.,
Agapito, J.A., Martín, M.A. y González, J.: «Off-odours identification in wine with a gas sensors based
System» (enviado a Thin Solid Films)
Santos, J.P., Cachero, A.H., Lozano, J., Vásquez, H.,
Agapito, J.A., Martín, M.A. y González, J.: «Clasificación e identificación de vinos mediante un sistema de
sensores de estado sólido» XXI Jornadas de Automática 2000, Sevilla (ISBN: 84-699-3763-6).

Para más información, contactar con josepe@eucmos.sim.ucm.es  
El análisis del aroma en el control de calidad de los vinos
Jordi Torrens
Jefe de Cromatografía del Laboratorio del Grupo Freixenet
La calidad, la innovación, el diseño, la formación de recursos humanos y la imagen de la marca constituyen los factores clave del desarrollo en todas las actividades económicas y, por tanto, también en la producción vinícola. En este contexto, el análisis químico y sensorial tiene cada vez más peso específico. El problema técnico de la calidad, entendida como el cumplimiento de las propiedades intrínsecas y las especificaciones dentro del marco legal, se resolverá mejor cuanto mejor se conozca el vino, sus constituyentes y las transformaciones que tienen lugar en él; la innovación y el diseño de nuevos productos serán casi siempre el resultado de avances científicos basados en el análisis químico y sensorial. Todos estos factores influyen en la imagen de la marca.
Tradicionalmente, el análisis sensorial ha sido y es la herramienta básica para la caracterización del aroma. A pesar de las numerosas normas y protocolos que se han establecido para estandarizar la metodología y los descriptores aromáticos, nunca dejará de estar sometida a la subjetividad del degustador. Los avances tecnológicos en el campo del análisis instrumental han permitido investigar a fondo los compuestos responsables del aroma y determinar el complejo perfil aromático del vino, pero todavía están lejos de poder interpretar las percepciones que se reciben durante la degustación. Disponemos, por tanto, de dos herramientas complementarias que, si somos capaces de conjugar, aportarán mucha información en cuanto a la evaluación del aroma.
Con este objetivo describiremos las características fundamentales y la relación entre los dos tipos de análisis, las recientes innovaciones, sus aplicaciones, limitaciones y perspectivas, en relación con el control de la calidad en la propia industria y no tanto en la investigación.
Análisis sensorial
La degustación de un vino, su estimación y apreciación organolépticas, junto con su descripción, constituyen lo que entendemos por análisis sensorial. En este proceso tiene mucho que ver el aspecto afectivo, es decir, la subjetividad del individuo hacia las sensaciones, emociones y recuerdos que puede despertar en él un determinado olor. La razón de ello es que en la percepción gustativa/olfativa coexisten dos etapas que tienen que ver con la química y la psicología. En primer lugar, se produce un conjunto de reacciones bioquímicas entre las moléculas del aroma/gusto y nuestras papilas. Ello genera señales eléctricas que, enviadas por el sistema nervioso, son procesadas en el cerebro, que identifica el gusto/olor y les asigna una descripción.
Con el fin que la subjetividad del catador no tenga tanto peso específico en la degustación hay que intentar estandarizar la descripción de los vinos y establecer unas reglas y criterios que permitan degustar un vino con el máximo rigor. De esta forma, diversos estamentos, tales como CEE, OIV, ISO, etc., han descrito normativas. Concretamente, la ISO-TC 34/SC12 describe normas sobre las copas a utilizar, acondicionamiento de las salas de degustación, metodologías para el análisis, descriptores para la elaboración del perfil aromático, guía para la selección, entrenamiento y control de los degustadores, etc.
La evolución del análisis sensorial no sólo debe ir a la búsqueda de metodologías más precisas y objetivas, sino que debe ser sensible a la introducción de nuevos productos, a la calidad de los vinos actuales, las exigencias del mercado y a los gustos del consumidor.
Al experto en el análisis sensorial también se le pide la capacidad de prever la evolución del producto. Así, la necesidad de disponer en la industria alimentaria de una análisis sensorial preciso obliga a tener un panel más numeroso y experto: según una estimación estadística, para la formación de un experto en análisis sensorial se requiere un mínimo de tres años de experiencia profesional, degustando del orden de 30 muestras diarias. A pesar de ello, no más del 10% de la población es apta para esta tarea.
Además, el análisis sensorial no nos proporcionará información sobre la composición química del aroma. Por tanto, se trata de un instrumento limitado a la búsqueda de las causas de determinadas alteraciones organolépticas, así como para la detección de adulteraciones y la tipificación del producto según su origen y variedad. No obstante, cabe señalar que la incorporación de técnicas instrumentales, como la detección olfatométrica y la nariz electrónica, requieren el análisis sensorial para su calibración e interpretación.
Análisis instrumental
Veamos qué aspectos del aroma se pueden determinar mediante su análisis: evaluación cuantitativa y cualitativa de los compuestos aromáticos, determinación y caracterización aromática de los compuestos impacto, e interpretación instrumental del aroma global. Respecto a las limitaciones, ya conocidas, vienen determinadas por la experiencia de los catadores, el número de participantes y la metodología empleada.
Identificación y cuantificación de los compuestos aromáticos. Cromatografía de gases
La incorporación de la técnica de la cromatografía de gases (conocida por sus siglas en inglés, GC) en el análisis del aroma ha permitido la identificación y cuantificación de los componentes volátiles del vino. Describiremos algunas de las innovaciones que han permitido mejorar la sensibilidad, selectividad, reproducibilidad, rapidez y automatización en las etapas de la GC: extracción y concentración de los componentes volátiles, separación cromatográfica y detección.
• Extracción y concentración de la fracción aromática por microextracción en fase sólida (SPME): Se trata de una de las técnicas más recientes y con mayores perspectivas para la extracción y concentración de volátiles en el vino. Estos compuestos se extraen mediante una fibra que se introduce directamente en el inyector del cromatógrafo, donde son desadsorbidos a altas temperaturas e introducidos en la columna. La buena sensibilidad del método se debe al alto rendimiento de la extracción por parte de la mayoría de los compuestos; su sencillez se basa en que apenas se requiere tratar la muestra, y que permite la automatización. Además, las condiciones de trabajo (temperatura y tiempo de extracción) y las fibras utilizadas proporcionan una determinada versatilidad. Su desventaja principal es la necesidad de controlar al máximo las condiciones para alcanzar una reproducibilidad aceptable.
• Separación por cromatografía de gases multidimensional (MDGC): Aunque la incorporación de las columnas capilares optimizó la separación de compuestos, la utilización de una única columna en matrices complejas como el vino a menudo no es suficiente para la separación de ciertos analitos. La cromatografía de gases multidimensional (MDGC) permite la conmutación de varias columnas, la posibilidad de optimizar el análisis según la adaptación de la técnica utilizada, la reducción del tiempo de análisis por purga de aquellos compuestos con tiempo de retención alto y sin interés analítico (back purgue), la utilización de precolumnas con gran capacidad de carga que extraen y concentran los analitos (heart cut), la prepurga del disolvente para eliminar las interferencias que produce (solvent flush), etc.
• Detección por acoplamiento de GC y espectrometría de masas (MS): El detector de ionización de llama ha sido el más utilizado en GC para el análisis de aromas. Su empleo ha quedado muy reducido en los últimos años debido a la incorporación de la MS. Los espectrómetros de masas pueden trabajar según dos métodos: el método scan, en el que se registra la suma de la intensidad de todos los iones, y el método del ión selectivo (SIM), en el que se registra la intensidad de aquellos iones que nos interesen.
La cromatografía, entendida como un método de separación, constituye una herramienta útil para separar los componentes volátiles, identificarlos y cuantificarlos. Así se han identificado en torno a unos 800 componentes volátiles en el vino.
Aplicaciones y limitaciones de la GC en la industria
La GC es muy útil cuando pretendemos identificar los compuestos que determinan una característica aromática conocida. Por tanto, es necesario conocer los umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirtúa nuestro producto, ya sea mediante estudio bibliográfico o por detección olfatométrica. Esta información es un instrumento útil para el seguimiento del producto en el proceso productivo, así como el control de otros materiales enológicos, como son los tapones y las barricas. Algunos controles importantes a efectuar durante la fase de crianza en vinos y cavas son métodos específicos para la determinación de fenoles volátiles y compuestos azufrados(Francioli, 2000). Concretamente en el cava, a partir de la evolución de ciertos compuestos volátiles, entre ellos los vitispiranos, se calcula el momento en el que tienen lugar las fases de autólisis y postautólisis durante la crianza. Controlar el momento en que se desarrollan estas fases es importante debido a las alteraciones organolépticas que conllevan.
La información que nos puede suministrar la GC en el control de calidad será más grande cuanto mejor conozcamos el perfil cromatográfico de la fracción aromática de nuestro producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de datos del mismo en las diferentes etapas de elaboración y en diferentes añadas, y correlacionar estadísticamente determinados compuestos con ciertas anomalías, o tipificar variedades que no contengan compuesto específico alguno que las identifique (como sucede en la mayoría de casos). No obstante, se trata de análisis todavía demasiado laboriosos para constituir aplicaciones rutinarias de control.
En todo caso, el análisis por GC no nos permite definir el perfil aromático del vino analizado. El problema se agrava en aquellos compuestos para los que no disponemos de patrones sintéticos y, por tanto, no es posible conocer sus propiedades aromáticas.
Caracterización aromática de los compuestos. Detección olfatométrica
La detección olfatométrica o snifing (GCO) permite determinar el perfil aromático de un vino a partir del análisis cromatográfico. Los compuestos, una vez separados y eluidos de la columna, se huelen (esnifan). Para distinguir entre aromas activos e inactivos se define el parámetro «valor de actividad aromática» (OAV), que mide la actividad aromática de un compuesto en una matriz determinada. Los compuestos aromáticamente activos serán aquellos que tengan un valor de aroma superior a 1.
El método se optimiza con la introducción del factor de dilución y la evaluación de series de diluciones de la muestra. Las técnicas de dilución más empleadas son el análisis Charm y el AEDA (de aroma extract dilution analysis). Cuando aplicamos la ley de Stevens, una ley psicofísica para la representación de percepciones sensoriales, a los valores obtenidos para casa compuesto y los normalizan, obtenemos los valores espectrales del aroma, que representados gráficamente configuran el espectro aromático del vino (figura 1).
Hasta ahora la olfatometría se ha desarrollado principalmente a través de la interpretación olfativa del vino. A pesar que las apreciaciones nasales son más discriminantes y reproducibles que las apreciaciones bucales, y que en la descripción de la singularidad de un vino la evaluación por la nariz parece la más apropiada, hay notas como las herbáceas, de madera y pimienta, que se perciben más intensamente en boca. Para simular la percepción aromática por vía retronasal se han introducido técnicas consistentes en la retención de los vapores retronasales de un individuo sobre un polímero, durante y después de la degustación y posterior análisis por GCO.
Aplicaciones y limitaciones de la GCO en la industria
La técnica de GCO aplicada a la industria nos permite conocer los compuestos aromáticamente activos, la importancia de cada uno de ellos y el perfil aromático del producto durante las diferentes etapas de elaboración. Cuando el producto sufre una alteración organoléptica, la GCO también permite detectar qué compuestos alterados son los responsables del cambio aromático. Escudero (1999a) determina qué compuestos de entre los que se forman durante la oxidación de un vino tienen significación sensorial. El mismo autor también identifica los compuestos responsables de la evolución del aroma del champán durante la crianza sobre lías (Escudero, 1999b).Las limitaciones de la técnica son la falta de sensibilidad para aquellos compuestos en los que el umbral de percepción es menor que el de detección, la discriminación de compuestos durante la extracción y concentración, y la incapacidad de interpretar los efectos de sinergia y antagonismo entre los diferentes compuestos aromáticos.
Interpretación quimiométrica del aroma global. Nariz electrónica
Lo que se pretende con estos instrumentos es conseguir réplicas fiables del olfato con máquinas dotadas de sistemas de detección que responden a la presencia de moléculas. Las señales emitidas son diferentes según la composición de la fracción volátil de la muestra. Estas señales son procesadas por sistemas quimiométricos que evalúan calidades aromáticas y/o cuantifican determinados compuestos (figura 2). Para que el instrumento establezca los modelos apropiados para cada aplicación es necesario proporcionar unos patrones previos.
La nariz electrónica consta básicacente de tres módulos: el sistema de recogida de muestras, el sistema de detección y el tratamiento estadístico de los datos.
• Recogida de muestras: Es similar a otras técnicas cromatográficas, pero los compuestos no se separan antes de llegar al detector mediante una columna cromatográfica, sino que son detectados conjuntamente.
• Sistema de detección: El más adecuado será capaz de detectar la gama más amplia de familias químicas. Se utilizan dos: los sensores de gases y la espectrometría de masas. Los primeros se basan en la facultad de modificar sus propiedades eléctricas cuando los compuestos del aroma interaccionan en su superficie. Presentan buena selectividad y sensibilidad: tienen respuesta distinta frente a diferentes compuestos y pueden detectar diferencias del orden de mcg/L; pueden ser óxidos metálicos, polímeros conductores o sistemas de radiofrecuencia. Los principales problemas son la inestabilidad frente a pequeñas variaciones de temperatura y humedad del gas portador, y el envenenamiento cuando hay presencia de algún componente mayoritario, como el etanol en el caso del vino. Los espectrómetros de masas obtienen el espectro correspondiente a los fragmentos de todo el conjunto de compuestos volátiles de la muestra.
La detección es más selectiva que en los sensores de gases y evita las interferencias debidas al agua y al etanol. Los inconvenientes respecto a los sensores químicos son una menor sensibilidad y una menor robustez, hecho que convierte en frecuentes las recalibraciones.
• Tratamiento de datos: El método de análisis de datos más utilizado se basa en la variancia estadística de los datos y determina los factores de discriminación de las muestras, pero no clasifica las muestras en grupos. Dentro de los métodos de clasificación, los más utilizados son el modelado suave independiente de las analogías de clase o SIMCA (de soft independent modelling of class analogy), que nos indica si la muestra analizada corresponde o no a un grupo de muestras de referencia, y el análisis factorial discriminativo o DFA (de discriminant factorial analysis), que indica a qué grupo corresponde la muestra.
Aplicaciones y limitaciones de la nariz electrónica en la industria
La incorporación de narices electrónicas al campo de la enología es muy reciente. En sectores como el alimentario, cosmético y farmacéutico, su efectividad ya ha sido demostrada tanto en lo que atañe a aspectos de I+D como al control de calidad. Las perspectivas de su aplicación en la enología también son buenas. Cabe mencionar la detección de sustancias anómalas, concretamente las tóxicas, aspecto preocupante para cualquier industria alimentaria. Tiene algunas ventajas como método de control de calidad, respecto a las técnicas cromatográficas: el tiempo de análisis es de 5 a 10 minutos, el control puede ser continuo y no requiere personal calificado, y se trata de un método no destructivo. Es una herramienta idónea para el control de la materia prima, los procesos y el producto acabado. Gutiérrez (2000) realizó un trabajo de tipificación de vinos según las zonas y variedades mediante la nariz electrónica. Las limitaciones de la técnica vienen dadas por la efectividad de los detectores. Una innovación que puede mejorar este aspecto es la reciente incorporación de equipos que combinan los dos sistemas de detección.
Conclusiones
Si consideremos los 800 compuestos aromáticos que pueden intervenir en la configuración aromática de un vino y las múltiples interacciones entre sí llegaremos a la conclusión que el análisis del aroma no es un problema sencillo. Se complica si además tenemos en cuenta la complejidad del olfato humano, con más de 100 millones de receptores olfativos. Pero hay diversas técnicas de estudio que, a pesar de sus limitaciones, proporcionan información valiosa y complementaria sobre diferentes aspectos de los aromas: caracterización organoléptica (análisis sensorial), composición química cualitativa y cuantitativa del aroma (cromatografía de gases), caracterización aromática individual de los compuestos (detección olfatométrica) y modelación quimiométrica del aroma global (nariz electrónica). Es necesario que el enólogo conozca estas técnicas en el momento de buscar respuestas a sus necesidades.
Bibliografía
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Escudero, A., Charpentier M. y Etievant P.: «Caracterización de los aromas de envejecimiento de Champagne mediante GCO y análisis descriptivos», Jornadas científicas del Grupo de Investigación Enológica, 1999b. Zaragoza, España.
Etiévant, P., Aubry, V., y Escudero, A.: «Avances en la investigación sobre los aromas del vino», XVI Congreso Internacional del Cava, 1998. Sant Sadurní d’Anoia, España.
Francioli, S.: «Influencia del periodo de crianza en el aroma de los cavas», Tesis Doctoral. Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, 2000.
Chatonnet, P.: «Discrimination and control of  toasting intensity and quality of oak wood barrels», Am J Enol Vitic 2000; 50 (4): 479-494.
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Gutiérrez, F. J., Horrillo, M. C., Sayago, I., Arés, L., Fernández, M. J. y Gómez, R.: «Sensores inteligentes. Aplicaciones industriales de sensores olfativos»,Alimentación. Equipos y tecnología 2000 (Enero/Febrero): 175-178.
Bayo, I. F.: «Narices electrónicas», El País 20/6/99.
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Moléculas de importancia sensorial
Juan F. Cacho, V. Ferreira y R. López
Grupo de Cromatografía, Aromas y Enología.
Departamento de Química Analítica. Facultad de Ciencias.
Universidad de Zaragoza
El vino es una bebida que se elabora para el disfrute de los sentidos. En consecuencia, todas las operaciones que se llevan a cabo con él, desde las tecnologías de bodega hasta las campañas publicitarias para incrementar su venta inciden en el aspecto sensorial. Un consumidor, tras recorrer con la vista la globalidad de la mercancía expuesta en un comercio, dirigirá de forma subconsciente sus pasos hacia la estantería en la que se encuentra la botella que ha captado la atención de su cerebro. La adquisición posterior de la misma dependerá de otros factores; precio, marca, añada, etc., pero despertar la atención es el primer objetivo que hay que conseguir. Por esta razón los vinos rosados se embotellan en vidrio incoloro, transparente, y al enólogo se le pide que consiga un color bonito y que el vino este transparente y brillante.
El consumidor no repetirá la adquisición de esa marca si, al degustarlo, el vino no cumple con las expectativas despertadas con el sentido de la vista. El vino ha de tener un aroma, sabor y sensación en boca acordes con lo esperado. Olfato, gusto y tacto, por tanto, también desempeñan un papel decisivo y el trabajo en bodega cada día se orienta más a exaltar estas características y conseguir estabilizarlas.
En los últimos años, el color del vino tinto ha despertado gran interés. Lo ha hecho no tanto por contribuir al disfrute del vino por el sentido de la vista, sino por su asociación con el gusto, y porque al estar relacionada la cantidad de materia colorante con las propiedades beneficiosas del vino para la salud, el consumidor identifica un vino con mucho color con un vino saludable.
Sin embargo, de los cinco sentidos el olfato es posiblemente el que más contribuye al disfrute del vino, por lo que es lógico que se haya dedicado un gran esfuerzo en investigar la composición de su aroma. A este aspecto vamos a dedicar nuestra atención.
Características de las sustancias odoríferas
Para que una sustancia produzca la sensación de olor debe alcanzar la pituitaria en cantidad suficiente para desencadenar una respuesta que recoja el cerebro. Esto difícilmente puede lograrse si la sustancia no es relativamente volátil por lo que, en un principio, se puede considerar que las sustancias no volátiles son inodoras y que las sustancias responsables del aroma del vino tienen volatilidad contrastada. Como consecuencia inmediata, el estudio del aroma del vino se orientó durante muchos años al conocimiento de la composición química de sus compuestos volátiles.
Sin entrar a discutir las técnicas y metodologías analíticas utilizadas para este fin, su límite de identificación y cuantificación y la reproducibilidad de sus resultados parece razonable pensar que un listado de componentes volátiles del vino con sus concentraciones no va a proporcionar información sobre las características aromáticas. La volatilidad es una condición necesaria, pero no suficiente, para que una sustancia huela; es necesario que tenga un grupo osmóforo y una estereoquímica adecuada. Para tener una idea de la importancia sensorial de una sustancia se necesita conocer, además de su concentración, su umbral de detección olfativa en la matriz que se estudia, en este caso el vino. El umbral de detección se define como la concentración mínima de la sustancia capaz de ser percibida por una media de la población. Sustancias con umbral de detección muy bajo pueden contribuir enormemente al aroma de un vino, aun estando a concentraciones también muy bajas, y es posible que otras sustancias a concentraciones altas no contribuyan al olor, al ser su umbral de olfacción alto. Por tanto, para conocer la importancia sensorial de una sustancia se necesitan dos valores: su concentración y su umbral de olfacción, o algún dato relacionado.
El valor de aroma se define como la relación entre la concentración de la sustancia y su umbral de olfacción y se expresa en unidades de aroma. Se considera que una sustancia no participa en el aroma del producto evaluado si su valor de aroma es menor que la unidad, y sí que lo hace cuando dicho valor es mayor que uno. La participación es tanto mayor cuanto mayor es el valor de aroma.
La aplicación de los conceptos y datos de valores de aroma debe hacerse con precaución ya que, si bien permite juzgar de una manera objetiva la contribución de los distintos compuestos aromáticos, no tiene en cuenta ciertas limitaciones: fundamentalmente no considera los efectos sinérgicos y antagónicos de los odorantes, y no tiene en cuenta las leyes de la percepción. El valor de aroma supone que la percepción es directamente proporcional a la intensidad del estímulo, y eso no es correcto. Por ello se hace una corrección que transforma los valores de aroma en valores de potencia o intensidad aromática (1). En el caso de los odorantes del vino, el valor de la intensidad aromática es igual al valor de aroma elevado a 0,6 (2,3).
Para comparar el aroma de diferentes vinos se ha sugerido comparar el denominado espectro del aroma. (4). Éste se obtiene normalizando los valores de intensidad aromática, otorgando un valor de 100 al del compuesto de mayor intensidad. La representación gráfica de esta intensidad relativa para componentes odoríferos permite el reconocimiento de perfiles y la comparación entre muestras. El aspecto y su comparación son similares a los obtenidos en espectrometría de masas. Para simplificar, normalmente sólo se representan valores que superan una cifra.
Otro aspecto importante en relación con los componentes que contribuyen al aroma es la sensación que produce su olfacción. Sensación cualitativa, relativa a la identificación del olor y asimilación a un producto o situación emocional determinada, es decir, un efecto de memoria; sensación cuantitativa, relativa a la intensidad del olor; y sensación afectiva, en cuanto a aceptación o rechazo. Estas tres cualidades del olor permiten describir con propiedad el aroma de un producto.
Descripción y medida del aroma
El análisis sensorial es hoy en día una disciplina científica perfectamente establecida y reglamentada. En España ha sido AENOR quien ha indicado los criterios para la realización de las pruebas (5), aunque la terminología para el análisis descriptivo de los vinos españoles no está estandarizada, y los comités de cata de cada Consejo Regulador de Denominación de Origen y de cada bodega utiliza una propia. Ello supone un problema a la hora de comparar resultados. Nuestro grupo investigador está actualmente trabajando para armonizar la nomenclatura de los catadores de zonas del norte de España productores de vino tinto. Los resultados presumiblemente se harán públicos en el año 2002 (6).
A.C. Noble et al. (7) propusieron en 1987 una terminología estandarizada para describir el aroma del vino, que modificaba y ampliaba una propuesta en el 1984, conocida como la rueda de los aromas (8). El sistema permite describir una sensación sobre la base de tres términos, de general a particular, con indicaciones para preparar con productos naturales los patrones con los que se entrenarán los paneles de análisis sensorial. En este sistema la sensación de aroma podría ser, por ejemplo, fruta, bayas, frambuesa (en este orden), y las muestras patrón se prepararían a partir de frambuesas frescas o congeladas y un vino tinto neutro.
Consensuada la terminología descriptiva de un tipo de vino, sus descriptores, y asignando valores a la sensación, es posible crear una escala para cada descriptor en la que se represente lo observado para diferentes vinos. Las escalas se disponen como radios de una circunferencia con el cero, común para todas, en el centro de la misma. La comparación de los valores en las distintas escalas, que normalmente se unen por líneas dando una figura similar a una tela de araña, permite diferenciar las características sensoriales de los vinos en términos semicuantitativos. Conocida la composición química de los mismos puede establecerse la relación con la impresión sensorial.
El análisis cualitativo de los compuestos volátiles del vino ha puesto de manifiesto que existen más de 800 compuestos pertenecientes a familias químicas bien distintas y en cantidades que varían en un intervalo enormemente amplio, desde porcentajes del 14 al 16% hasta ultratrazas, por debajo de 0,5 mcg/L-1. Es imposible, por tanto, obtener el valor de aroma para todos los componentes de un vino, aunque se conozca su umbral de detección, y poder determinar la importancia de cada odorante particular.
Con el objeto de resolver esta situación se ha recurrido a diversas estrategias, todas ellas basadas en la separación de los componentes volátiles del vino mediante cromatografía de gases y detección de los mismos a la salida de la columna cromatográfica por medio de la nariz humana. Se suele analizar un extracto del vino, y el problema analítico radica en la concordancia entre su composición cuantitativa y la del vino. La metodología aplicada se denomina olfactometría y la más utilizada es la conocida como AEDA (aroma extract dilution analysis(9).
En AEDA se pide a los olfateadores o sniffers que señalen cuándo aparece un olor a la salida de la columna al cromatografiar un extracto del aroma. Es decir, que su respuesta es huele o no huele, a tiempos determinados (los tiempos de retención cromatográfica de las sustancias odoríferas). Repitiendo el proceso con diluciones sucesivas del extracto van desapareciendo las sensaciones, hasta que llega un momento en que no se huele nada. Cada odorante en la muestra analizada tiene lo que se denomina un factor de dilución (FD), el valor de la dilución en la que se olió por última vez. Así, un olor detectado al diluir 100 veces el extracto, pero que no se detecta en una dilución superior, tendrá un valor de FD igual a 100. La representación gráfica de los FD frente a los tiempos de retención conduce a lo que se denominanaromogramas.
La diferencia entre un cromatograma clásico de un extracto y un aromograma es que en primero aparecen las señales de los compuestos que dan respuesta en el detector electrométrico y dicha respuesta es proporcional a su concentración, mientras que en el segundo aparecen las señales de las sustancias que huelen y su respuesta es proporcional a su valor de aroma. Por tanto en una aromograma pueden aparecer señales que no aparecen en un cromatograma, debido a que la sensibilidad humana en la olfacción sea alta y la concentración del odorante supere el umbral de detección mientras que la sensibilidad instrumental esté por debajo de la concentración del odorante que llega al detector. Y lo contrario cuando los compuestos volátiles no huelen.
Dado que se suele analizar el extracto concentrado de un vino, la concentración es decisiva para la obtención de resultados válidos. Si se concentra mucho, el aromograma obtenido tendrá muchas más señales y de mayor intensidad que si la concentración es menor y el resultado puede confundir al operador (10). Ello no significa que en el vino no se encuentren todos los componentes detectados, con las intensidades odoríferas relativas del aromograma, pero tal vez no todos contribuyen al olor, o lo hacen de forma menos acentuada. Así, las intensidades relativas del aromograma son las de los compuestos en disolución en el vino, no las que se encuentran en el espacio de cabeza (en fase gaseosa).
En el estudio de las moléculas de interés sensorial la estadística es una herramienta imprescindible para correlacionar las sensaciones con el análisis instrumental. La elección del método estadístico es compleja y dependerá de si se quiere correlacionar una variable sensorial o un conjunto, o bien un perfil obtenido en un análisis descriptivo con los datos cuantitativos cromatográficos o cualquier otro tipo de combinación. Los métodos más utilizados son el análisis discriminante paso a paso, la regresión lineal múltiple paso a paso y el análisis de componentes principales. También se utilizan el análisis parcial least squares (PLS) o mínimos cuadrados parciales y el análisis cluster.
En el libro Volatile compounds in foods and beverages (11), P. Etievant hace una magnífica recopilación de la información disponible, por familias de compuestos: éteres, alcoholes, terpenos, ácidos, etc., con tablas en las que figuran las concentraciones máximas y mínimas de los compuestos odoríferos en cualquier tipo de vinos y su umbral de detección en distintos medios. Desde esa fecha el conocimiento de la importancia sensorial de los componentes del aroma del vino se ha ido incrementando, puesto que se han cuantificado numerosos compuestos que se encuentran a nivel de trazas y ultratrazas. También se han identificado otros compuestos contribuidores natos al aroma, desconocidos hasta ese momento. Los trabajos de Grosch (12), Guth (13), Dubordieu et al. (14,15,17), Etievant et al. (16), Baumes et al. (18) y los de nuestro grupo (19), son algunos de los que más han contribuido a este conocimiento. Como ejemplo de la importancia sensorial de diversas moléculas en el vino vamos a considerar el vino tinto joven.
El aroma del vino tinto joven
En un estudio de este vino de las variedades de uva Garnacha, Tempranillo, Cabernet Sauvignon y Merlot con un número de muestras representativo (52 vinos) se obtuvieron datos cuantitativos de 47 odorantes que previamente se habían catalogado como contribuidores potenciales del aroma por técnicas de AEDA (4). Se establecieron sus valores de aroma medios, máximos y mínimos y, después de una corrección de perceptibilidad, los de intensidad aromática. Los resultados se muestran en la tabla 1, donde se observa que el número de sensaciones odoríferas y sustancias químicas responsables es muy alto comparado al de las que se encuentran en concentraciones significativas en alguno de los vinos. En las figuras 1 -4 se muestran los espectros de intensidad aromática de los cuatro vinos estudiados. Su comparación permite ver claramente el porqué de su distinto aroma.
El análisis de estos datos ha permitido obtener interesantes conclusiones: todos los vinos contenían 12 odorantes con valores de aroma superiores a la unidad y por tanto, contribuyentes natos del aroma de todos los vinos: cuatro ésteres (butirato de etilo, hexanoato de etilo, octanoato de etilo y acetato de isoamilo), probablemente responsables de las notas frutales; cuatro ácidos (butírico, hexanoico, octanoico e isovalerianico), cuyos descriptores aromáticos son grasa y lácteo; dos alcoholes superiores (isoamílico y fenil etílico), responsables de las notas fusel, y, por último, el diacetilo, con descriptor a mantequilla y leche, y la B-damascenona, con descriptor floral.
Si se calcula el número de odorantes a partir de los componentes que superan la unidad en alguno de los vinos, el número asciende a 32, confirmando la idea de que el aroma del vino es un problema complejo de difícil interpretación; hay numerosos odorantes y la posibilidad de interacción entre ellos es alta. En este grupo se encuentra la 3 isobutil-2-metoxipiracina con valores de aroma de 20 en vinos cabernet sauvignon).
Otro grupo de compuestos no alcanza el valor de aroma 1, por lo que no deberían contribuir al aroma. Tal afirmación debería ser comprobada por técnicas de reconstitución, ya que no se conoce el efecto sinérgico de estos compuestos.
Una forma interesante de discutir los resultados de valores de aroma o de intensidades aromáticas es considerar el global de ciertos grupos o familias de compuestos. Se ha encontrado que el 71% de las unidades de aroma de un vino medio corresponden a subproductos del metabolismo de las levaduras (ésteres, acetatos, ácidos, isoácidos y alcoholes de fusel). Sin embargo, los ésteres minoritarios y los compuestos norisoprenoides suponen un 19% de la intensidad del aroma, y los fenoles, lactonas y ésteres cinámicos aproximadamente un 5%; según estos valores, los aromas que proceden de la uva pueden suponer más de un 20% de la intensidad aromática total.
Resumiendo, el aroma del vino tinto joven tiene un aroma básico frutal, graso/láctico y alcohólico, constituido principalmente por ácidos grasos, alcoholes y, sobre todo, ésteres. Este aroma básico se enriquece con notas frutales, florales, lactónicas o fenólicas, que provienen de componentes de la uva.
Bibliografía
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Modificación genética de levaduras vínicas
Amparo Querol
Departamento de Biotecnología
Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA)
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Burjassot (Valencia)
La fermentación del mosto en vino es una reacción microbiológica compleja en la que se produce un desarrollo secuencial de levaduras y bacterias lácticas.1-4 Tradicionalmente, el vino se produce por la fermentación natural llevada a cabo por las levaduras. El origen de estas levaduras puede ser la superficie de las uvas o el ambiente de la bodega (maquinaria, fermentadores, etc.). La dinámica de la flora responsable del proceso fermentativo del mosto ha sido objeto de numerosos estudios.
La microflora presente en la superficie de la uva se ve afectada por un gran número de factores que influyen en la proporción de las diferentes especies. Entre estos factores se incluyen la temperatura, la pluviosidad y otras influencias climáticas,5,5a,6 el grado de madurez de la cosecha,7,8 el uso de funguicidas,9 el daño físico debido a hongos, insectos, etc.6 y la variedad de uva. Por otro lado, cuando la superficie de la maquinaria de la bodega, como prensas, tanques, fermentadores y bombas, entre otros elementos, entra en contacto con el mosto de uva constituye otra fuente de aporte de levaduras. Esta flora residente en el ambiente de la bodega está formada mayoritariamente por S. cerevisiae,10,11 aunque también se han aislado especies de los géneros Candida, Pichia, Hansenula y Brettanomyces. Sin embargo, la especieSaccharomyces cerevisiae es la responsable de la fermentación alcohólica a pesar de que sus niveles en la uva son bajos, alrededor de 50 células/mL,11 durante la fermentación se multiplica rápidamente y desplaza a otros microorganismos que eventualmente invaden el mosto. No obstante, variaciones en la flora inicial pueden influir en la calidad del vino y dar lugar a cambios en la acidez volátil y a sabores y olores desagradables.12
Utilización de levaduras seleccionadas en vinificación
Desde un punto de vista microbiológico, la variabilidad en la flora levaduriforme de los mostos puede solventarse adicionando en cada campaña de vendimia un inóculo microbiano que, al ser mayoritario, normalice la flora inicial y, de esta forma, dé lugar a una fermentación homogénea año tras año. Aunque cultivos líquidos de levadura vínica han sido utilizados desde 1930 (Instituto Laclaire, Francia), las levaduras vínicas secas no se originaron hasta mediados de los años cincuenta, cuando de forma independiente varios laboratorios europeos, canadienses y estadounidenses llevaron a cabo una selección de levaduras vínicas que posteriormente utilizaron como inóculo en fermentaciones dirigidas.11 Todos ellos concluyeron que las levaduras vínicas seleccionadas crecían bien en una fermentación de mosto y que producían un buen vino. Desde entonces, en varias zonas de Europa, Estados Unidos, Canadá y Australia se realizan fermentaciones utilizando cultivos iniciadores.13 Hoy se comercializan más de cien cepas diferentes pertenecientes principalmente a seis casas comerciales.
Aunque pueden producirse diferencias en la diversidad microbiana del mosto inicial, ya no sólo entre regiones vitivinícolas distintas, sino también dentro de la misma bodega en diferentes vendimias, la utilización de levaduras seleccionadas produce fermentaciones controladas y, como consecuencia de esta práctica, el vino mantiene sus características sensoriales típicas en cada región.14 Según Cuinier,15 la utilización de levaduras seleccionadas puede evitar alteraciones químicas y microbiológicas en las primeras fases de la fermentación. Por otra parte, también puede evitar anomalías de la fermentación, como paradas espontáneas, o mejorar la composición química e influir en la calidad, tanto gustativa como aromática del vino. Por esta razón, en los últimos años, se ha extendido el uso de levaduras autóctonas de cada región.16
Los estudios de identificación y caracterización de las diferentes especies de levaduras, así como de las cepas que pertenecen a una misma especie han estado basados en criterios morfológicos y fisiológicos.17,18 Estas características pueden variar en función de las condiciones de cultivo y, en ocasiones, las especies han sido delimitadas por una única característica fisiológica, que en algunos casos estaba controlada por un solo gen. Más recientemente se han desarrollado técnicas de biología molecular que se presentan como una alternativa a los métodos tradicionales para la caracterización e identificación de levaduras. Esteve-Zarzoso et al.19 han llevado a cabo una revisión de las técnicas que se aplican en la identificación y caracterización de levaduras.
Por otra parte, también resulta interesante la caracterización de cepas de levaduras con dos fines: en primer lugar, para controlar el proceso de elaboración de levaduras secas activas y, en segundo, para comprobar la implantación de las levaduras comerciales durante la fermentación alcohólica en la bodega. Se han desarrollado diversas técnicas moleculares para la caracterización de cepas vínicas.12,20 Querol et al.21 han desarrollado un método de análisis del DNA mitocondrial (mtDNA) que evita la utilización de gradientes en cloruro de cesio y el uso de una ultracentrífuga, factor limitante para su utilización en la industria. Esta técnica rápida permite el análisis de un mayor número de cepas en menos tiempo, y su aplicación resulta ideal en la industria por su rapidez, seguridad y economía, y por no requerir material sofisticado ni personal muy especializado. Mediante esta técnica Querol et al.22 han mostrado la implantación y el papel de una levadura seca activa (LSA) que había sido inoculada en las fermentaciones de dos bodegas distintas. Se demostró que la cepa inoculada competía con las cepas naturales pero no suprimía completamente su crecimiento hasta varios días después de haber sido inoculada. Sin embargo, el predominio de la cepa inoculada era evidente en ambas bodegas y representó el 68,09 % y el 89,46 % de las colonias aisladas en la fase final de la fermentación.
El uso de levaduras inoculadas y la demostración formal mediante técnicas moleculares de su imposición, junto con los avances en biotecnología, abren la puerta a la modificación genética de las levaduras vínicas.
Mejora genética de levaduras vínicas
Las características genéticas de una levadura vínica pueden ser modificadas según las necesidades de la industria vitivinícola. Se han desarrollado diversas levaduras utilizando técnicas clásicas como la inducción y selección de mutantes, y la hibridación y fusión de protoplastos.23 Sin embargo, la aplicación de las técnicas de DNA recombinante se presenta como un enfoque más sencillo y preciso, tal como veremos a continuación.
Los pasos básicos para clonar un gen y transformar una levadura vínica (figura 1) son:a) identificación del gen que le va a conferir una característica nueva a la levadura y aislamiento del fragmento de DNA foráneo; b) identificación y linearización mediante el uso de enzimas de restricción del vector (plásmido) que va a servir para introducir el nuevo gen en la levadura (dicho plásmido posee sistemas de selección para las levaduras transformadas o modificadas genéticamente); c) transformación de la levadura, es decir, introducción del vector con el gen en el interior celular; d) selección de las levaduras transformadas, aquellas que han incorporado el plásmido con el nuevo gen; estos sistemas están basados mayoritariamente en resistencias a antibióticos. Estos plásmidos pueden permanecer de forma independiente en la célula o pueden ser «integrativos», o sea que el nuevo gen se integra en una zona concreta del genoma de la levadura eliminando el DNA no necesario del vector y los genes responsables de las resistencias a antibióticos.
Siguiendo esta metodología es posible construir cepas que expresen actividades metabólicas de interés o que ejerzan efectos beneficiosos en las características organolépticas de los vinos.12,23 Se han desarrollado diversas levaduras vínicas recombinantes. En la figura 2 se muestra la estrategia utilizada para obtener alguna de estas levaduras. Por ejemplo, se han diseñado levaduras vínicas que, al contener los genes que codifican los factores killer K1 y K2, presentan una ventaja ecológica evidente, ya que las levaduras vínicas naturales sólo expresan el factor K1 y, por tanto, son resistentes únicamente a este factor killer. También se ha descrito la construcción de cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae que, al expresar el gen de la L(+)-lactato deshidrogenasa de Lactobacillus casei, pueden llevar a cabo una fermentación mixta (lactoalcohólica) y por ello solventar el problema de baja acidez de los vinos de regiones cálidas. Aparte de la fermentación alcohólica, la fermentación maloláctica es un proceso tecnológico de gran importancia en enología. Mediante su uso se logra desacidificar los vinos tintos y algunos vinos blancos en regiones frías. Esta fermentación la llevan a cabo bacterias ácido lácticas, sobre todo Oenococcus oenii, y rebaja la acidez de los vinos al descarboxilar el ácido L-málico a ácido L-láctico. La reacción está catalizada por el llamado enzima málico que ha sido purificado de varias bacterias ácido lácticas. Los genes correspondientes han sido clonados a partir de aislados de Lactobacillus delbrueckiiLactococcus lactis y Oenococcus oenii. Las cepas deS. cerevisiae no pueden metabolizar el malato del mosto, por lo que la idea de expresar el gen que codifica el enzima málico en la levadura vínica ha sido un objetivo prioritario de la biotecnología enológica. De hecho, durante los últimos años varios grupos han informado sobre la construcción de levaduras vínicas que, si bien expresaban eficazmente genes bacterianos que codifican el enzima málico, no daban lugar a la desacidificación. Recientemente se ha conseguido una vía eficaz de degradación de málico en S. cerevisiae. Para ello se ha construido una levadura recombinante que porta un gen de la levadura Schizosaccharomyces pombe, que codifica una malato permeasa y el gen de L. lactis que codifica el enzima málico. Esta levadura es capaz de fermentar 4,5 g/L de malato en mostos artificiales en tan sólo cuatro días.
Otro ejemplo interesante del uso de las técnicas de ingeniería genética en enología lo constituye la construcción de levaduras vínicas recombinantes que expresan genes que codifican celulasas y hemicelulasas. Es una práctica habitual en las bodegas la adición de estos enzimas para solventar problemas de filtración o incrementar aromas afrutados, pero la heterogeneidad de las preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que varía según el lote) ha hecho de su uso algo impredecible. En nuestro laboratorio se han construido diversas levaduras vínicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos que codifican beta-(1,4)-endoglucanasa, alfa-L-arabinofuranosidasa, beta-glucosidasa, endoxilanasas y alfa-ramnosidasas. Todas estas levaduras son capaces de secretar los enzimas correspondientes al mosto en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnológico y producir vino con adecuadas características organolépticas. También se ha desarrollado una levadura recombinante que contiene un gen fúngico que codifica una pectato liasa útil para solventar problemas de filtración. Todas estas cepas se pueden usar como herramientas para investigar el papel individual de cada enzima en el proceso de vinificación. En la actualidad estamos investigando sobre el papel de los enzimas puros y la combinación de enzimas más adecuada, dependiendo de las variedades de uva. Otra de las líneas de investigación del grupo, recientemente iniciada, consiste en aumentar la producción de los aromas secundarios mediante el incremento de la capacidad de síntesis de ésteres por parte de la levadura durante la fermentación alcohólica.
La modificación genética de las levaduras vínicas exige conocer promotores de genes de levaduras que se expresen específicamente durante determinados tiempos de fermentación. Estos promotores se pueden comparar con los interruptores de la luz que encienden o apagan, es decir, que permiten que el gen codifique o no lo haga para la proteína de interés. Por ello, diversos trabajos de investigación tienen como objetivo entender la regulación de la expresión génica en S. cerevisiae durante la vinificación. En la actualidad se dispone de varios promotores que se inducen específicamente durante la prefermentación, fermentación tumultuosa o posfermentación.24 Por otra parte, estos estudios nos han permitido constatar que a nivel de expresión génica, las levaduras se comportan de forma muy distinta en condiciones de laboratorio o en vinificación, incluso se pueden observar diferencias según la variedad de mosto que se va a fermentar (figura 3).
Por último, merece mención especial el reciente desarrollo de protocolos de transformación para las levaduras vínicas que rinden levaduras recombinantes GRAS (de Generally Recognized As Safe) mediante sistemas de integración en el genoma de las levaduras evitando el uso de resistencias a antibióticos, uno de los mayores problemas en el uso de microorganismos modificados genéticamente.25
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