27/2/15

Los tioles varietales

Los tioles varietales: información actualizada sobre las vías de la biogénesis y el impacto de técnicas vitivinícolas
Aurélie Roland,1 Florine Cavelier,2 y Rémi Schneider1,3 
1Nyseos SARL, Montpellier, Francia
2IBMM, UMR-CNRS 5247, Montpellier, Francia
3IFV, UMT Qualinnov, Domaine de Pech-Rouge, Gruissan, Francia
Los tioles varietales y particularmente la 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), el acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA) y el 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) han sido identificados como compuestos claves en el aroma de los vinos jóvenes procedentes de diversas variedades (fig. 1).
Figura_1
Figura 1: Estructura química de tres tioles varietales encontrados en los vinos. 1: 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona; 2: acetato de 3-mercaptohexilo; 3: 3-mercaptohexan-1-ol.
La contribución de estos compuestos al aroma del vino ha sido destacada por Du Plessis y Augustyn1 quienes han demostrado que el aroma de guayaba en los vinos sudafricanos de sauvignon se debió principalmente a la presencia de 4MMP. A diferencia de otros compuestos azufrados tales como el disulfuro de carbono, el etanotiol, el metanotiol o el sulfuro de hidrógeno producidos en altas concentraciones durante la fermentación alcohólica y responsables de defectos olfativos, los tioles varietales se encuentran en algunos vinos de Vitis vinifera en cantidades traza. Tienen olores agradables a brotes de casis, maracuyá y pomelo.
En los últimos 20 años, el interés de los científicos y de los técnicos por estos compuestos ha crecido mucho. Este artículo pretende dar una actualización sobre las vías de biosíntesis y el efecto de algunas técnicas vitivinícolas sobe el contenido de los vinos.
Los tioles varietales: aparición y contribución sensorial
La 4MMP fue formalmente identificada por primera vez en vinos de sauvignon blanc2-5 después en los de scheurebe,macabeo,6 gewürztraminer, riesling, muscat, colombard, manseng petit y tokay.7,8
Los 3MH y 3MHA son más ubicuos que la 4MMP ya que se encuentran en una amplia gama de vinos varietales tales como sauvignon blanc,9,10 petite arvine,11petit y gros manseng,8,12 melon B. y bacchus,13 sémillon,8 verdejo,14 pero también en las variedades rojas tales como grenache,15 merlot y cabernet sauvignon16,17 y los vinos rosados de Provenza.18
La 4MMP tiene olor a boj y a brote de casis2-4 y está a menudo presente en concentraciones inferiores a 70 ng/L. Su umbral de detección olfativa es de 0,8 ng/L en solución hidroalcohólica.8 El 3MH y 3MHA, que son más abundantes, dan al los vinos blancos y rosados notas frutales de maracuyá y de pomelo.8,12,19 Sus umbrales de olor esta respectivamente en 60 y 4 ng/L.8 Hay que añadir que se considera el 3MH como responsable de aromas de casís en algunos vinos.20
La cromatografía de gas acoplada a la olfatometría (GC-O) es un método interesante para seleccionar moléculas activas en el perfil sensorial de los vinos. Esta técnica, que usa la nariz humana como detector, permitió la identificación de la 4MMP en los vinos de sauvignon blanc.2 Asociado con técnicas de dilución (AEDA - Aroma Extract Dilution Analysis), la GC-O ha permitido identificar la 4MMP como el compuesto de mayor contribución en el aroma de los vinos de Scheurebe.21Estudios similares han demostrado el papel central del 3MH en el aroma de los vinos de Sauternes.22 En paralelo con los experimentos olfatometría, el ratio de la concentración de un compuesto sobre su umbral de olor puede ayudar a determinar las moléculas más olorosas en el vino. Este enfoque ha permitido poner de relieve la contribución de los tres tioles varietales en el aroma de viejos vinos españoles,24 mientras que el 3MHA es uno de los compuestos aromáticos más olorosos en los vinos de marmajuelo y de verdello.24
Sin embargo, el GC-O no tiene en cuenta los efectos de interacción entre los compuestos volátiles y entre la matriz. Para llenar este vacío, se han desarrollado experimentos de reconstitución de aroma. Esta es la mejor manera de medir la contribución de las interacciones con el aroma del vino. Una estrategia basada en el impacto cualitativo y cuantitativo de los compuestos olorosos, seguido de pruebas de omisión ha demostrado que el 3MH es un compuesto clave en los vinos rosados de Ggrnacha.15 Análisis sensorial y químico realizados en paralelo pueden, en situaciones sencillas, ayudar a establecer el vínculo entre los compuestos de aroma y las sensaciones olfativas, como se demostró recientemente en Nueva Zelanda donde los niveles de 3MH y 3MHA permiten predecir el carácter «frutas tropicales» de los vinos de sauvignon.25 Para otras sensaciones, la predicción es más difícil, incluso para los vinos sauvignon, como en el caso del carácter vegetal donde varios compuestos interactúan (2-isobutil-3-metoxipirazina, compuestos C6, 4MMP), y especialmente, porque que se intenta relacionarlo a las preferencias del consumidor.26,27
Las vías de biogénesis en los vinos
La 4MMP, el 3MH y el 3MHA son aromas varietales liberados durante la fermentación, a partir de precursores inodoros presentes en las uvas y los mostos.
Tres rutas biogenéticas de formación de la 4MMP y del 3MH han sido identificadas en los vinos (fig. 2). La formación del 3MHA es especial y se hace por acetilación del 3MH por la levadura.28
Figura_2
Figura 2: Las vías de biogenesis de los tioles varietales en los vinos.
La primera via implicando precursores cisteinilados fue identificada por primera vez en la uva sauvignon blanc,29,30 merlot y cabernet sauvignon,16 semillon,31 petit y gros manseng,12 riesling, melon b. y gewürztraminer32 y, finalmente, koshu.33Estos conjugados de la S-cisteína son escindidos por la levadura con la actividad β-liasa durante los primeros días de fermentación.30 La S-3-(hexan-1-ol)-cisteína (Cys3MH) es mas ubicua y abundante que la S-3-(4-mercapto-4-metil-2-ona)-cisteína (Cys4MMP),16,34,35 lo que es consistente con las proporciones relativas de los tioles correspondientes. Estos precursores cisteinilados se encuentran frecuentemente en las plantas como recuerda Starkenmann36 y, por lo tanto, constituyen una fuente importante de aroma para la industria.
La segunda vía implica precursores glutathionilados: el S-3-(hexano-1-ol)-glutatión (G3MH) identificado de manera tentativa en la uva de sauvignon blanc,37 y formalmente en la de melon b.,34 riesling32 y gewürztraminer,32 y luego Chardonnay,38 pinot gris38 y koshu33 y el s-3-(4-mercapto-4-metil-2-ona)-glutatión (G4MMP) presente en la uva de sauvignon blanc,39 riesling y gewürztraminer.34 Diferentes estudios realizados en medio modelo40,33 o en mostos de sauvignon blanc32, dopado con G3MH y después fermentado mostraron la presencia en los vinos correspondientes de 3MH. Se demostró así que el G3MH era otro precursor del 3MH. Se observaron resultados similares para el G4MMP en mostos de sauvignon Blanc.41
La formas glutationiladas están generalmente presentes en las uvas y mostos a niveles inferiores a las formas cisteiniladas,41 y el G3MH es siempre mucho más concentrado que el G4MMP lo que es coherente con la distribución de los tioles correspondientes en los vinos (tabla 1). Las concentraciones varían entre 0,2 y 7,3 µg/l para el sauvignon blanc, el melon b., el riesling y el gewürztraminer;41 Los contenidos en G4MMP son mucho más bajos, entre 0,03 y 4,3 µg/L.
Tabla 1: Contenidos medios en precursores de tioles en diferentes variedades
Tabla_1
Por último, una última vía de biogénesis ha sido identificada en el pasado. Esta ruta implica compuestos insaturados en C6 tal como el (E)-2-hexenal que reciben un grupo sulfhídrico durante la fermentación alcohólica.48 Sin embargo, el donador de azufre aún no ha sido identificado: podrían ser compuestos tales como el H2S, la cisteína, el glutatión u otros compuestos que poseen un tiol libre en los mostos.
Los principales factores de variación en la viña
Los cambios en los precursores de tioles en el viñedo han sido poco estudiados, debido a la dificultad de análisis. Los pocos resultados disponibles conciernen a los efectos de la madurez, la ubicación del viñedo (terroir), el nivel de estrés hídrico y la fertilización nitrogenada. La evolución de los precursores cisteinilados durante la maduración se ha estudiado desde el principio de la década del 2000 en sauvignon: si la maduración es favorable a la acumulación de estos precursores en los granos, la cosecha es muy importante.35 Se demostraron similares resultados en Sancerre y Touraine con la uva sauvignon y para todos los conjugados de la cisteína y del glutatión aunque la evolución de la Cys4MMP parezca más dependiente de la ubicación física de la vid.49
El nivel de estrés hídrico tiene un efecto sobre los precursores cisteinilados y en este contexto, los contenidos en Cys3MH parecen proporcionales al nivel de estrés (en la región de Burdeos), mientras que la Cys4MMP tiene un comportamiento opuesto.50
El mismo autor informa de una relación entre la fertilización de nitrógeno en el suelo y el contenido en precursores (y glutatión) mientras que disminuye el nivel de polifenoles que contribuye a la producción de vinos más ricos en tioles.51 Del mismo modo, la pulverización foliar de nitrógeno después el envero aumenta el contenido en tioles de los vinos sin aumentar el vigor y ni el Botrytis cinerea como puede ocurrir en el caso de una fertilización de nitrógeno en el suelo mal controlado.52 Este aumento en tioles, parece más debido al efecto del aumento en nitrógeno asimilable de los mostos que en el aumento directo de los precursores.
Los principales factores de variación durante la vinificación
Durante la preparación de los mostos
La elaboración de los mostos es un paso clave en el proceso de vinificación de los vinos blancos y rosados.
El prensado de la uva provoca una liberación en el medio de ácidos hidroxicinámicos (ácido caftarico principalmente), que, en presencia de polifenoloxidasa endógena y de oxígeno produce o-quinonas. Cuando está presente el glutatión en el vino, estas quinonas reaccionan con este tripéptido para formar el GRP (grape reaction product).53,54 Cuando el contenido en glutatión baja, estas quinonas se condensan con otros sustratos polifenólicos tales como los flavonoides para formar pigmentos marrones.
Durante este etapa de elaboración del vino, los tioles varietales están presentes en forma de S-conjugados y no son oxidables, dado la estabilidad en condiciones enológicas del enlace tioéter. Consistentemente, Roland et al.49 han mostrado que los niveles de precursores cisteinilados al 3MH y a la 4MMP y que la G4MMP eran estables durante los experimentos de oxidación controlada sobre mostos de sauvignon y de Melon mientras que las concentraciones en G3MH aumentaban. Esta formación puede ser el resultado de la adición de glutatión sobre el (E)-2-hexenal, un producto de la oxidación enzimática de los lípidos insaturados de la uva. Asi esta reacción podría explicar la formación de G3MH durante las operaciones prefermentativas.49
Otras técnicas tal como la maceración permiten aumentar el contenido en tioles de los vinos. La localización de los precursores de tioles en el grano de uva, de preferencia en la piel, explica la ganancia en precursores después de la maceración lo que ya ha sido observado por varios autores.55,16,56,57 Hay que señalar que en esta asignación, existen diferencias entre los precursores (Cys4MMP más en la pulpa que en la piel) o entre las variedades (el G3MH de la variedad Melon está preferentemente en la pulpa). Además, al producirse la extracción conjunta de los polifenoles durante la maceración los enólogos deben ser moderados con esta técnica, ya que son perjudiciales para el mantenimiento de los tioles en los vinos (ver más adelante apartado sobre el envejecimiento).
Durante la fermentación alcohólica
Los tioles varietales son liberados durante los primeros días de fermentación porSaccharomyces cerevisiae a través de su actividad de β-liasa. Según los autores, varios58 o un solo gen, IRC759 están implicados en la escisión de la Cys4MMP. La conversión del Cys3MH parece más compleja. En estos estudios, el determinismo genético de la reacción de escisión sólo concierne a los conjugados de S-cisteína y no existen datos disponibles para los conjugados del glutatión. Por lo tanto, la elección de la cepa de levadura es un factor crítico en la producción tioles en los vinos. Muchas levaduras comerciales tienen una buena capacidad para liberar tioles.58,60-62 Sin embargo, seria arriesgado intentar clasificar las cepas por orden de eficacia ya que un estudio reciente ha demostrado que el origen del vino y su composición, eran factores importantes de diferenciación de los vinos (Schneider, comunicación personal). Por otra parte, hay que señalar que la combinación de cepas puede ser una manera eficaz para aumentar la producción de 3MH y 3MHA.63Estudios recientes han puesto de relieve el interés de las cepas no-Saccharomycescomo Pichia kluyveri64 o híbridos interespecíficos tal como S. cerevisiae x S.bayanus var. uvarum.62,65 Sin embargo, hay que tener en cuenta que los rendimientos de conversión de levadura no es superior al 10% en enología.
Sin embargo, pocos estudios se han centrado en el tema del transporte de los precursores de tioles en la célula de la levadura, una etapa clave para la escisión. El transportador de aminoácidos ha sido identificado como un transportador de precursores cisteinilados en medios modelos.66 La síntesis de este transportador se reprime por un exceso de amonio (Nitrogen Catabolic Repression). Así, el tipo y el momento de adición de nutrientes nitrogenados durante la fermentación debe ser controlado para permitir una mejora en la producción de tioles en vinos.
La temperatura de fermentación es también un factor importante que afecta la producción de tioles. La fermentación a 20 °C parece ser más favorable que a 13°C,67 pero esta observación parece depender de la cepa de levadura considerada.58
Durante el almacenamiento y el envejecimiento
Después de la fermentación, los tioles están en forma libre, y por lo tanto son químicamente inestables y fácilmente oxidables. Reaccionan fácilmente con otros compuestos de vino por adición nucleófila.68,69
Se debe controlar cuidadosamente las aportaciones de oxígeno a partir de este momento. Por ejemplo, hay que cuidar el oxígeno en el espacio de cabeza al embotellado y el OTR (Oxygen Transmission Rate) de los corchos ya que pueden provocar pérdidas aromaticas significativas a partir de un período de almacenamiento de 24 meses.70,12,71 Dependiendo del tipo de vino, el oxígeno puede ser perjudicial para la calidad aromática porque además de provocar colores marrones puede disminuir el contenido en tioles varietales72. Los mecanismos subyacentes implican la formación de aductos entre las moléculas de tiol, que son electrófilas, y algunos compuestos fenólicos.73 Así, la presencia de (+)-catequina y (-)-epicatequina con hierro (III) cataliza su oxidación en quinonas que se añaden a los tioles.
Sin embargo, la ausencia de oxígeno en el embotellado puede causa la aparición de defectos de reducción significativa y se debe encontrado un promedio de acuerdo con el tipo de vino y su duración de «vida».
El envejecimiento sobre lías antes del embotellado, la presencia constante de SO2libre, de glutatión y de antocianinas en el caso de los vinos tintos y rosados, favorecen una mejora preservación de los aromas del vino.74,75,76
Conclusión
Los aromas del vino de tipo tiol son fuertemente influenciadas por las técnicas vitícolas y enológicas. Cuando uno quiere producir un vino con un alto contenido en tiol, es necesario:
- Favorecer la acumulación de los precursores en la uva.
- Manejar la extracción de los precursores en los mostos blancos y rosados.
- Aumentar los ratios de conversión eligiendo una cepa de levadura, condiciones de fermentación y una nutrición nitrogenada adecuadas.
- Y, finalmente, mantener los compuestos producidos en los vinos mediante controles de oxigeno por ejemplo.
Hay que llevar a cabo numerosos estudios en estas áreas para poder manejar la vinification del vino, pero los resultados presentados aquí sugieren algunas pistas que se pueden integrar en los procesos de elaboración.
Además, si la contribución de los tioles es bien conocida en ciertos modelos de vinos (cabernet, colombard, algunos vinos rosados) los trabajos futuros deberían permitir entender mejor el papel de las interacciones de estos compuestos con otros compuestos volátiles lo que implica una fuerte colaboración multidisciplinar de la química con la fisiología del olfato.
Nota
Este artículo está basado en la intervención de uno de los autores (Rémi Schneider) en la Jornada titulada Proyecto Vinaromas: coloquio internacional sobre los aromas del vino, que tuvo lugar en Zaragoza el 22 de noviembre de 2012. Para más información sobre el proyecto visite www.projet-vinaromas.eu.

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17/2/15

Bases moleculares del aroma del vino


Vicente Ferreira
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología. I3A. Universidad de Zaragoza.
Vamos a tratar de la aproximación sistemática a la base química del aroma del vino, derivada del conocimiento adquirido en años recientes, acerca no tanto de la naturaleza química de los componentes aromáticos como de la manera en la que estos interactúan entre sí y con otros componentes para producir las distintas sensaciones aromáticas. Dicho conocimiento ha puesto de manifiesto la existencia de una serie de reglas básicas cuya base está fundamentada en la observación empírica, pero que son consistentes con las leyes de la percepción y que permiten explicar de manera satisfactoria cuál es el papel jugado por los distintos grupos de componentes en la formación de las notas aromáticas del vino. Básicamente podemos asimilar el aroma del vino a un juego en el que es posible identificar sus diversos componentes: 1) el campo de juego, que está formado por lo que denominamos el búfer aromático del vino; 2) los jugadores, que son los distintos componentes aromáticos y; 3) las reglas de dicho juego.
La base del aroma del vino. El búfer aromático
El búfer aromático está integrado por cerca de una treintena de componentes volátiles derivados de la fermentación alcohólica (alcoholes, ácidos, ésteres y algún compuesto carbonílico) y por la β-damascenona, componente esencial del aroma de la uva. Esta mezcla de compuestos tiene varias propiedades básicas que condicionan en gran medida las propiedades sensoriales del vino. En primer lugar reúne a componentes tanto de características agradables y frutales (ésteres, β-damascenona), como a componentes de olores más agresivos e incluso desagradables (alcoholes de fusel y ácidos), formando un conjunto de olor característico que se suele definir como vinoso y en el que no es posible diferenciar los olores de los componentes individuales. Por supuesto existen diversas combinaciones de esta mezcla básica que mostrarán distintos matices aromáticos y que tendrán las propiedades que enunciaremos a continuación en distinto grado.
Las propiedades de esta mezcla aromática las definimos como búfer aromático, en analogía con los búferes químicos que empleamos para ajustar el pH. Y esto es así, porque al igual que un búfer permite contrarrestar el efecto sobre el pH de la disolución de un ácido o una base añadidas sobre la misma, el búfer aromático contrarresta el efecto sobre el olor de la disolución causado bien por la adición de un odorante, bien por la eliminación de uno de los que constituyen la base.
Clasificación de odorantes de acuerdo con su papel potencial
Obviamente el búfer puede llegar a romperse, permitiendo de esta manera que el vino adquiera notas aromáticas más definidas e interesantes que las que caben dentro del adjetivo «vinoso». Por observación, sabemos que el búfer se puede romper mediante la acción de moléculas aromáticas actuando de tres maneras distintas:
- Mediante una molécula única en concentración suficiente.
- Mediante un grupo de moléculas homólogas química y aromáticamente actuando de manera concertada o «familias de moléculas».
- Mediante un gran grupo de moléculas que comparten una característica genérica (frutal, dulzona, floral…) o «confederación de moléculas».
A esta molécula o grupo de moléculas capaz de romper el búfer la denominaremosvector aromático. Y ya sea una molécula única, una familia de moléculas, o más raramente una confederación de moléculas, el efecto sensorial causado por un vector aromático sobre cualquier mezcla aromática compleja, como es el búfer del vino, será función de su concentración y de su integración sensorial en el entorno.
En una primera aproximación podemos identificar los siguientes papeles para cualquier vector aromático en una mezcla compleja:
· Compuestos o familias impacto. Transmiten su aroma específico a la mezcla. El olor del componente es claramente reconocido en el aroma global. Su omisión causa un cambio radical en el aroma que se desnaturaliza y se hace irreconocible.
· Contribuyentes mayoritarios. Contribuyen de manera principal, pero no en exclusiva, a una nota importante del aroma de la mezcla. Aunque el olor del componente no se puede reconocer en el aroma de la mezcla, su omisión causaría un fuerte cambio cuantitativo y una distorsión cualitativa.
· Contribuyentes netos. Contribuyen de manera neta, pero no principal, a una nota aromática de la mezcla. Su omisión causaría una disminución neta de la intensidad de dicha nota aromática de la mezcla, pero solo cambios menores en el perfil cualitativo.
· Contribuyentes minoritarios o sutiles. Contribuyen junto con muchos otros componentes a una nota genérica del aroma. La omisión de uno solo de estos componentes puede pasar totalmente desapercibida.
En función de la «exclusividad» de su aroma y del rango de concentraciones en que puede aparecer en el vino, encontraremos algunas moléculas que de manera individual pueden llegar a jugar incluso el papel de compuesto impacto. En segundo lugar identificaremos vectores aromáticos formados por varias moléculas que, en ocasiones, podrían llegar a ser compuestos impacto, y por último hablaremos brevemente de las confederaciones de moléculas.
Vectores monomoleculares o compuestos impacto
Hasta la fecha se han descrito 16 compuestos que, en algunos vinos del mundo, alcanzan concentraciones suficientes como para actuar como genuinos componentes impacto. Son los siguientes:
- Procedentes de la uva o de precursores glucosídicos: linalol, óxido de rosa cis, β-damascenona, β-ionona y rotundona.
- Procedentes de la uva mediante precursores cisteinílicos: 4-metil-4-mercaptopentanona, 3-mercaptohexanol y acetato de 3-mercaptohexilo.
- Procedentes de las fermentaciones: acetato de isoamilo y diacetilo (que juega un papel ambiguo).
- Procedentes de la madera: whiskylactona.
- Procedentes de la evolución oxidativa: metional, fenilacetaldehído y sotolón (compuestos todos ellos con papeles ambiguos).
- Procedentes de evolución reductiva: furfuriltiol y bencilmercaptano.
Esto quiere decir que es posible encontrar en el mercado vinos de calidad en los que se identifica el olor de estas moléculas, de acuerdo con la definición de compuesto impacto. Obviamente se trata de vinos de aromas muy marcados, como los vinos de moscatel, gewurztraminer o los de Sauternes. Por otra parte, en muchos otros vinos en los que se encuentran en cantidades más pequeñas estos componentes jugarán roles más modestos, bien como contribuyentes mayoritarios, netos o incluso como minoritarios. En cualquiera de los casos, estos 16 componentes son responsables de 16 notas aromáticas características que podemos encontrar de manera más o menos explícita en los distintos vinos.
Las familias de aromas
En el vino, como en muchos otros productos naturales, encontramos varios grupos de moléculas homólogas, esto es; moléculas con la misma estructura química pero distinto tamaño. Estas moléculas en general se producen en la misma vía de síntesis, en la uva, levadura o bacteria o incluso en la madera y también sucede que en la mayor parte de las ocasiones comparten aroma. Un ejemplo característico son las γ-lactonas, ya que en los vinos se pueden encontrar cinco miembros de esta familia (γ-octa, γ-nona, γ-delta, γ-undeca y γ-dodecalactonas). Todas estas moléculas tienen un aroma parecido que recuerda al coco o al melocotón. En general, en muy pocos vinos, estas moléculas se encuentran en concentraciones superiores al umbral, de manera que en la mayor parte de los casos actúan como simples contribuyentes minoritarios. Ahora bien, el hecho de que coexistan en el vino cinco moléculas con aromas similares hace que la nota aromática formada por la conjunción aditiva de todos ellos pueda llegar a ser considerada en su conjunto como un contribuyente mayoritario e incluso impacto. A este conjunto aromático lo denominamos familia aromática. Una familia aromática puede igualmente jugar en el vino los papeles de impacto, contribuyente mayoritario, neto o minoritario.
Por orden potencial de importancia encontramos:
1. Ésteres etílicos de ácidos grasos (butirato, hexanoato, octanoato y decanoato de etilo).
2. Acetatos de los alcoholes de fusel (acetatos de isoamilo, isobutilo, hexilo y feniletilo).
3. Ésteres etílicos de los ácidos ramificados (ésteres etílicos de los ácidos isobutírico, 2-metilbutírico, isovaleriánico, 2,3 y 4-metilpentanoicos y ciclohexanoico).
4. γ-lactonas: γ-octa, γ-nona, γ-delta, γ-undeca y γ-dodecalactonas.
5. Isoaldehídos: isobutiraldehído, 2-metilpentanal, isovaleraldehído.
6. Aldehídos alifáticos: octanal, nonanal, decanal.
A estas familias «puras» de compuestos realmente homólogos, hay que añadir otras familias «mixtas» en las que las estructuras químicas guardan similaridad pero no son, estrictamente hablando, compuestos homólogos y los olores tienen fuertes similaridades pero son claramente distinguibles:
7. Familia de la vainilla: vanillina, vanillato de etilo, vanillato de metilo, acetovanillona, siringaldehído.
8. Familia de azúcar quemado: furaneol, maltol, homofuraneol, sotolón.
9. Fenoles volátiles: guaiacol, eugenol, isoeugenol, 2,6-dimetoxifenol, 4-alil-2,6-dimetoxifenol.
10. Etil cinamato y dihidrocinamato.
Algunos componentes descritos en el epígrafe anterior, cuando se encuentran en niveles bajos, pasan a actuar dentro de una familia:
11. Terpenoles (linalol, geraniol, α-terpineol, β-citronelol, nerol).
12. Nor isoprenoides frutales y/o vegetales (β-damascenona, β-ionona, α-ionona, vitispiranos, TDN, theaspirano, etc.).
Es importante notar que hay algunos componentes que aparecen en varias de las listas anteriores, lo que no debe sorprendernos dados los amplios rangos de concentración en que se pueden encontrar en los distintos vinos. En cualquiera de los casos, debemos considerar que las familias aromáticas son responsables de alrededor de 10 notas aromáticas distintivas que podemos observar en muchos vinos (a añadir a las 16 descritas en el epígrafe anterior).
Confederaciones de minoritarios
Por último, cuando un vino no contiene ninguno de los vectores anteriormente definidos en el nivel suficiente como para jugar un papel activo, su aroma más allá del vinoso del búfer puede ser debido a la acción conjunta de varios de dichos vectores para promover un atributo genérico. Esto ocurre en algunos vinos blancos de variedades neutras en los que las notas dulzonas, reminiscentes de polen de flores, se deben a la acción conjunta de cerca de una veintena de moléculas derivadas de precursores glucosídicos y pertenecientes a familias de terpenos, norisoprenoides, vainillas y γ-lactonas.
Potenciadores del aroma
Un potenciador del aroma es una molécula que provoca un aumento de la intensidad aromática de una mezcla por encima de lo atribuible a su propia intensidad aromática. La potenciación aromática es un fenómeno que no está bien documentado científicamente aunque los perfumistas aluden con naturalidad al mismo. De manera empírica podemos aventurar que se da en aquellos casos en los que un atributo aromático de una determinada molécula completa o complementa los de la mezcla a la que se añade, produciendo un nuevo concepto aromático que se percibe con mayor claridad e intensidad. En el vino se ha documentado de manera parcial la acción potenciadora de la β-damascenona, del furaneol y homofuraneol y del sulfuro de dimetilo sobre la percepción de las notas frutales.
Defectos o distorsionadores del aroma
Hay numerosas moléculas bien conocidas por los enólogos que son responsables de defectos aromáticos en el vino, desde el avinagramiento hasta el TCA, pasando por el 4-etilfenol. Lo que ya no es tan conocido es que algunas de estas moléculas catalogadas como defectos, además de algunas otras que están sin catalogar, pueden ejercer un efecto sensorial muy pernicioso sobre la calidad del vino a niveles muy por debajo de los que son considerados de riesgo.
El efecto del 4-etilfenol es uno de los mejor conocidos. Está claramente documentado que pequeñas concentraciones de este compuesto, a niveles muy inferiores a su umbral de identificación, causan una importante disminución de la intensidad del aroma frutal, pudiendo llegar a causar una total supresión aromática. De alguna manera, es como si estas moléculas revirtieran la rotura del búfer aromático causado por las moléculas positivas del aroma, en definitiva como si hicieran que el búfer aromático se hiciera más potente. En cualquiera de los casos, si esa molécula –que no se percibe como tal– fuera eliminada del medio, la consecuencia sería un aumento claro de las notas aromáticas positivas del vino. Puede decirse entonces que es preciso reconsiderar la noción de defecto.
Apuntes finales
Los grandes vinos tienen que ser complejos, lo que exige que en su aroma se puedan reconocer múltiples matices. Desde el punto de vista químico-aromático esto implica que en un gran vino tienen que coincidir varios de los vectores aromáticos mencionados anteriormente en una situación en la que ninguno predomine claramente sobre los otros.
El problema esencial es que, en el momento en que uno de los vectores domina, la percepción se simplifica en gran manera pasando bien a la de un producto agradable pero no muy apreciado, o bien a la de un producto simplemente desagradable por incongruente. La presencia simultánea de varios vectores aromáticos que han quebrado el búfer se puede resolver mediante una situación de tablas, en las que ambos matices aromáticos se perciben de manera conjunta en lo que podemos denominar una interacción competitiva, o bien mediante una interacción creativa, en la que aparece un nuevo concepto aromático. En el caso en que uno de los vectores esté dentro del grupo de «defectos», o sea totalmente incongruente con el otro, es posible que lo que aparezca sea una interacción destructiva con una disminución parcial o total del aroma del vino.
Agradecimientos
El trabajo experimental que ha dado lugar a estos conceptos ha sido generosamente financiado por el Plan Nacional de I+D del Gobierno español (proyecto ALI230-183).

10/2/15

EL DOMINIO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA:

Cómo controlar la nutrición de las bacterias enológicas y minimizar el efecto de los inhibidores
Magali Déleris-Bou, José María Heras y Sibylle Krieger-Weber
Lallemand SAS, Blagnac, Francia

INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo trataremos en detalle las necesidades de las bacterias enológicas en cuanto a fuentes de carbono y nutrientes que contienen nitrógeno, vitaminas y minerales. También se hará hincapié a que la carencia de ciertos elementos nutricionales en un mosto o en un vino puede tener una gran incidencia en la fermentación maloláctica (FML), por ello, es importante comprender dichas  necesidades  y conocer las herramientas de las que dispone el enólogo para lograr una FML sana y completa.

LAS BACTERIAS ENOLÓGICAS TIENEN UNAS NECESIDADES NUTRICIONALES COMPLEJAS

Metabolismo de los carbohidratos 
En el vino, los azúcares constituyen la principal fuente de energía para las bacterias lácticas desempeñando así un papel esencial en su crecimiento. Los principales azúcares del vino (hexosas) son la glucosa y la fructosa. Las bacterias lácticas son capaces de utilizar ambas fuentes, aunque Oenococcus oeni prefiere la fructosa, el metabolismo conjunto de la glucosa y la fructosa ofrece ventajas en términos de energía.
Al final de la fermentación alcohólica (FA), la concentración de glucosa-fructosa es baja, pero satisface aún las necesidades de las bacterias, pues la concentración bacteriana es igualmente baja. En efecto, la mayoría de bacterias lácticas son capaces de utilizar otros monosacáridos presentes en el vino (por ejemplo, la arabinosa, la manosa, la galactosa, la xilosa, etc.) al igual que los polisacáridos y los compuestos glicosilados. O. oeni posee una actividad glucosidasa extracelular (Guilloux-Benatier et al. 1993 y Guilloux-Benatier et al. 2000). Otros  estudios tales como los de Grimaldi et al. 2000, MacMahon et al. 1999 y Mansfield et al. 2002, han identificado esta actividad glucosidasa y hoy sabemos que un gran número de precursores aromáticos se conjugan con los residuos glucosídicos o con los disacáridos de glucosa. Estos compuestos aromáticos se liberan por la acción de las bacterias enológicas.

Metabolismo de los ácidos orgánicos
Los principales ácidos orgánicos presentes en el mosto de la uva y en el vino al final de la FA y transformados por Oenococcus oeni son los ácidos málico y cítrico.
Ácido málico. La concentración de ácido málico en el mosto depende del grado de madurez de la uva y varía entre 0,7 y 8,6 g/L (Cabanis y Cabanis 1998). La principal reacción en la FML es la descarboxilación del diácido L-málico del vino en monoácido L-láctico. En el caso del vino, el sistema maloláctico es un mecanismo que le permite a O. oeni recuperar energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) sintetizado y mantener un nivel de pH intracelular propicio para la actividad enzimática y el desarrollo celular.
El ácido málico penetra la célula en su forma aniónica para ser descarboxilado en ácido láctico en el citoplasma celular. La descarboxilación permite el consumo de un protón intracelular y la expulsión de protones por parte de los simportadores lactato/H+. Un gradiente de protones –o «fuerza motriz protónica»– del medio vínico hacia el interior de las células mantiene el pH intracelular de las bacterias (aproximadamente a 6,0) y conduce a la formación de energía en forma de ATP.
Ácido cítrico. El ácido cítrico, componente importante del mosto de la uva y del vino, tiene una concentración que oscila entre 0,1 y 0,7 g/L. La vía de degradación del ácido cítrico por parte de las bacterias lácticas provoca la formación de tres tipos de compuestos: ácido acético, lípidos y derivados acetoínicos (acetoína, butanodiol y diacetilo). El metabolismo del ácido cítrico es también una fuente de energía para O. oeni.
En general, el consumo de ácido cítrico comienza después del consumo de ácido málico. En el caso de O. oeni, el efecto de la cepa es de gran importancia en lo que se refiere al momento del ataque del citrato y de la velocidad con la que se consume el ácido cítrico. Mientras que ciertas cepas que producen altos niveles de diacetilo empiezan a consumir el ácido cítrico desde la mitad de la FML, otras cepas –de mayor interés para los enólogos ya que permiten evitar las notas mantecosas– no empiezan a metabolizar el ácido cítrico  hasta que ya no quede más ácido málico por consumir (Krieger 2012).

METABOLISMO DE LAS FUENTES DE NITRÓGENO
Los aminoácidos libres y los que provienen de la hidrólisis de los péptidos son las principales fuentes de nitrógeno para las bacterias enológicas. Contrariamente a las levaduras, los aminoácidos que necesitan las bacterias enológicas no pueden ser sintetizados a partir del nitrógeno amoniacal. Por consiguiente, los aminoácidos deben provenir del medio o ser sintetizados por las bacterias mediante los precursores  carboxílicos.

Aminoácidos
La necesidad de aminoácidos de las bacterias depende no solo de la especie sino también de la cepa. La identificación de los aminoácidos esenciales para O. oeni ha sido objeto de muchos estudios. La técnica preferida consiste en comparar el crecimiento bacteriano en un medio que contenga todos los aminoácidos necesarios (un medio completo) con las bacterias de otro medio que carezca de uno de dichos aminoácidos.
Las investigaciones de Garvie en 1967, de Fourcassié et al. en 1992, de Remize et al.en el 2006 y de Terrade et al. en el 2009 trataron las necesidades de nueve, seis, cinco y dos cepas de O. oeni, respectivamente. Las diferencias entre las metodologías utilizadas por los investigadores (por ejemplo, el medio de cultivo, las cepas utilizadas, la etapa de lavado de la biomasa, los trasplantes sucesivos, etc.) explican los diferentes resultados que se obtuvieron de estas investigaciones.
La siguiente tabla, adaptada del libro Les bactéries lactiques en œnologie de Alexandre et al., resume los resultados de estas investigaciones.
Dependiendo de cada caso, se dice que el aminoácido que falta en el medio de cultivo es:
  • Esencial, cuando la biomasa que se forma representa menos del 20% de la biomasa del cultivo testigo.
  • Necesario, cuando la biomasa que se forma representa entre el 20% y el 80% de la biomasa del cultivo testigo.
  • Indiferente, cuando la biomasa que se forma representa menos del 80% de la biomasa del cultivo testigo.

Tabla 1: Comparación de los aminoácidos necesarios para 22 cepas de Oenococcus oeni (adaptada de Les bactéries lactiques en œnologie de Alexandre et al.) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf ]

La arginina es un aminoácido esencial para las 22 cepas estudiadas. Así, aminoácidos como el ácido glutámico, la isoleucina, el triptófano, la metionina, la valina, la cisteína, la tirosina, la histidina y la fenilalanina son esenciales para el cultivo de la mayoría de cepas.
Por el contrario, la falta de prolina o de alanina en el medio no afecta al desarrollo de la mayoría de cepas, por lo cual, se consideran como aminoácidos indiferentes.
Los resultados que Remize et al. obtuvieron en el 2006 tras el estudio de dos cepas de O. oeni seleccionadas se presentan en las figuras 1 y 2.

Figura 1: Lalvin31®: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 2: Alpha™ MBR: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Los investigadores han estudiado también los requisitos de las cepas deLactobacillus. En Terrade et al. 2009, los autores concluyen que la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa de L. buchneri y una cepa de L. hilgardii es menor que la cantidad necesaria para dos cepas de O. oeni: cinco aminoácidos son esenciales para L. buchneri y ocho para L. hilgardii, en comparación con los 13 y 16 aminoácidos esenciales para las dos cepas de O. oeni.

Tabla 2: Nutrientes esenciales para cuatro cepas de bacterias enológicas (Terrade et al. 2009) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf ]

En la práctica, la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa es importante, pues esta indica que, en un medio que carezca de aminoácidos, las cepas deLactobacillus, que suelen ser indeseables, se desarrollaran más fácilmente que las cepas de O. oeni.
Péptidos
Además de los aminoácidos libres, los péptidos pueden constituir otra fuente de nitrógeno. Las bacterias enológicas tienen a la vez actividades proteolíticas (degradación de proteínas) y peptidolíticas (degradación de péptidos), y pueden obtener los aminoácidos necesarios o esenciales para su crecimiento gracias a los péptidos.
Las investigaciones acerca de la naturaleza del nitrógeno metabolizado por O. oenihan demostrado que la presencia de péptidos de levadura (fracciones entre 0,5 y 10 KDa) en el medio contribuyen sobre todo al desarrollo de O. oeni, en comparación con un medio que solo contiene aminoácidos libres (Remize et al. 2005). Asimismo, se ha demostrado que al metabolismo de los péptidos le sigue la liberación de aminoácidos libres hacia el medio.
Los péptidos parecen ser entonces la fuente de nitrógeno clave para el desarrollo deO. oeni. En términos de energía, las células bacterianas aprovechan el consumo de péptidos. En efecto, es bastante probable que ciertos péptidos estén más sujetos que otros a ser hidrolizados y transportados por las bacterias. Dichos péptidos son particularmente estimuladores puesto que permiten que se genere energía con una mayor productividad (Alexandre et al. 2008).
En la práctica, sabemos que en algunas variedades, como el chardonnay, resulta más difícil llevar a cabo la FML, aún en ausencia de factores inhibidores (por ejemplo, pH bajo, SO2 molecular alto), y se sospecha que la razón  sea una carencia de nutrientes esenciales. En el laboratorio de investigación y desarrollo de Lallemand, se han llevado a cabo ensayos para evaluar el impacto de la adición de varios péptidos a un vino chardonnay. Los resultados se obtuvieron después de haber adicionado un péptido considerado particularmente estimulador.
    Protocolo del experimento:
  • Medio: Vino blanco chardonnay (pH de 3,2, etanol  12,9%, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L)
  • Preparación de tres medios por cepa:
  • - Testigo: Vino sin ninguna adición
    - Vino + péptido a razón de 5 mg/L
    - Vino + péptido a razón de 20 mg/L
  • Inoculación en cada medio después  de la rehidratación de las bacterias MBR® A, B, C y D en agua no clorada durante 15 minutos, a 20°C
  • Incubación de las muestras de ensayo en recipientes de vidrio a 20°C
  • Seguimiento de la población bacteriana mediante su conteo en un medio MRS modificado.
La figura 3 presenta la población bacteriana siete días después de la inoculación. La adición de este péptido a razón de 5 mg/L al vino blanco chardonnay ejerce un efecto estimulador sobre el desarrollo de las cuatro cepas seleccionadas para el ensayo. Los estudios sobre O. oeni han demostrado que los aminoácidos ligados que son transportados al interior de la célula son  liberados y regresan al medio en su forma libre. Los péptidos, aunque fueron transportados, no son necesariamente consumidos (Ritt et al. 2008). La hipótesis propuesta era que dicho transporte se llevaba a cabo con el fin de ahorrar energía. En efecto,  parece que esta interiorización de aminoácidos ligados requiere menos energía que en el caso de los aminoácidos libres (Konings 2002 y Kunji et al. 1993), cuyo transporte puede realizarse por diferentes vías. Además, la excreción de aminoácidos libres por parte de los simportadores protónicos genera la fuerza protón- motriz  necesaria para la síntesis de ATP. Desde el punto de vista  energético, podría demostrarse que dicho péptido presenta una ventaja ya que mejora la resistencia de las bacterias en un medio ácido (pH de 3,2).

Figura 3: Impacto de la adición de un péptido con dos concentraciones diferentes (5 mg/L y 20 mg/L) al cultivo de cuatro cepas de bacteria Oenococcus oeni de un vino blanco chardonnay (Lallemand R & D) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

NECESIDADES EN VITAMINAS
Las bacterias lácticas necesitan varias vitaminas de la familia B, especialmente el ácido pantoténico (vitamina B5), la biotina (B8), la tiamina (B1) y la niacina (B3). Aunque la piridoxina (B6) y la riboflavina (B2) no son esenciales, estas también pueden contribuir al óptimo crecimiento de las cepas. El ácido pantoténico, presente en gran cantidad en el jugo de tomate al igual que en los jugos de uva y manzana, fue considerado por mucho tiempo como un factor de crecimiento especial para O. oeni y se encuentra en numerosos medios de cultivo de esta especie.
En un estudio realizado por Terrade et al. en el 2009, se demostró que la presencia de la niacina (B3) y del ácido pantoténico era esencial para el crecimiento de cuatro bacterias enológicas (dos O. oeni y dos Lactobacillus sp.), y que la riboflavina era solamente necesaria para dos bacterias Lactobacillus sp. La piridoxina (B6), por su parte, tenía un efecto estimulador en el cultivo de las cuatro cepas.

INFLUENCIA DE LOS MINERALES
Algunos minerales, como el magnesio, el manganeso, el potasio y el sodio son importantes bien porque son cofactores enzimáticos o bien porque intervienen en los mecanismos de transporte. Pocos estudios se han interesado en la necesidad de minerales de estas cepas.
Las bacterias enológicas tienen necesidades nutricionales múltiples y complejas, y el satisfacerlas contribuye al éxito de la FML. En consecuencia, cualquier carencia de estos elementos activadores del proceso de FML debe ser remediada con activadores específicos obtenidos a partir de levaduras inactivas específicas, las cuales son fuentes naturales de aminoácidos, péptidos, vitaminas y minerales, y son vitales para el crecimiento y la supervivencia de O. oeni.

ESTRATEGIAS PARA GARANTIZAR UNA FML COMPLETA
El vino es un medio no propicio para el desarrollo bacteriano
El vino constituye un medio estresante para las bacterias. Así pues, la acidez, el alcohol, los sulfitos y la temperatura (por debajo de 18°C) son factores que inhiben el crecimiento bacteriano. Además de ello, la levadura produce factores inhibidores durante la FA tales como el SO2, los ácidos grasos de cadena media y los péptidos. La carencia de nutrientes en el medio constituye también un factor inhibidor. Algunas prácticas en enología, como la clarificación, eliminan los nutrientes y las partículas en suspensión que favorecen el crecimiento bacteriano. Como se explicó antes, algunos aminoácidos son indispensables para el crecimiento de O. oeni. Hacia el final de la FA, el nivel de nitrógeno orgánico varía considerablemente de un vino a otro. Renouf (2013) ha publicado los resultados de su análisis con respecto al nivel de aminoácidos esenciales al final de la FA y antes de la FML en vinos de diversas varietdades (merlot, cabernet sauvignon, malbec, chardonnay, syrah, tannat y pinot noir) y de distintas denominaciones. Renouf expone las variaciones de los factores, clasificadas de 1 al 10, en el nivel total de aminoácidos vitales para el crecimiento deO. oeni. Lograr la FML completa fue particularmente difícil en el caso del vino con las mayores deficiencias.
Utilización de activadores de fermentación maloláctica
En general se considera que una buena FA depende de una cantidad suficiente de nutrientes para las levaduras y, asimismo, la FML necesita suficientes nutrientes para las bacterias. Hoy en día existen soluciones para lograr una FML completa.
La figura 4 presenta los resultados del análisis de ensayo realizado con un vino cabernet sauvignon (etanol  14% con un pH de 3,56; SO2 total <25 mg/L; SO2 libre de 5 mg/L), los cuales se encontraban dentro de los parámetros que se recomiendan para la bacteria Alpha MBR®.
Se compararon tres protocolos de FML:
  • Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR®
  • Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR® y adición del activador de fermentación Opti’Malo Plus® a razón de 20 g/hL
  • Vino testigo sin inoculación con bacterias específicas.
La temperatura de ensayo era de 18°C.
En el vino testigo, en el que no se inoculó ninguna bacteria seleccionada, la población bacteriana se mantuvo muy baja durante los 21 días del ensayo, sin llegar nunca a más de 1x104 UFC/mL. Con una población bacteriana tan baja, la concentración de ácido málico se mantuvo estable.
En el vino en el que se inocularon bacterias seleccionadas sin adición de ningún nutriente, la población bacteriana se mantuvo durante los primeros siete días tras la inoculación y luego empezó a disminuir paulatinamente. Diez días después de la inoculación, la muerte de las bacterias condujo al fin de la degradación del ácido málico.
Sin embargo, en el vino al que se le añadió el activador de FML se observó un crecimiento bacteriano rápido y continuo tras la inoculación. El ácido málico fue completamente metabolizado al cabo de 11 días. Este vino carecía probablemente de al menos un elemento esencial para el desarrollo de la bacteria Alpha.


Figura 4: Impacto de la adición de nutrientes para bacterias Opti'Malo Plus® en la fermentación maloláctica [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

El caso de los vinos blancos. Como ya se explicó, en el caso de los vinos blancos, especialmente del varietal chardonnay, el inicio de la FML se hace más difícil.
En un estudio de los vinos chardonnay, se analizaron los efectos de la inoculación con diversas cepas de bacteria y la adición de activadores de FML. Dicho estudio se centró en particular en los preparados de levaduras inactivas que contienen el activador peptídico cuyo efecto benéfico se muestra en la figura 1. Los resultados que se presentan en la figura 5 son un esbozo de las observaciones del estudio.
En el marco de esta investigación sobre el vino chardonnay, se compararon los siguientes protocolos:
  • Inoculación con la cepa de bacteria Alpha, Beta o PN4
  • Adición de un activador de FML a razón de 20 g/hL
  • Tipos de activadores: nutriente A (activador testigo) y un nuevo activador con un alto contenido en péptidos (Opti’ML Blanc®).
Dependiendo de la cepa utilizada, la FML sin adición de nutrientes puede durar entre 28 y 30 días. En este medio, muy probablemente con carencia de elementos esenciales para el crecimiento de las bacterias, el hecho de añadir un complejo de nutrientes rico en aminoácidos, péptidos y vitaminas reducirá ostensiblemente la duración de la FML, sea cual sea la cepa. Para las bacterias vínicas Alpha y Beta, el nuevo activador es más efectivo que el nutriente testigo.

Figura 5: Estudio sobre un nutriente para aplicación en chardonnay [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

El caso de los vinos tintos concentrados. En la práctica, lograr una FML con éxito también es difícil en los vinos tintos con altas concentraciones de polifenoles. Tal es el caso, por lo general, de los vinos merlot y tannat, del suroccidente de Francia, y del Graciano, de España.
Muchas investigaciones se han llevado a cabo con el fin de analizar la incidencia de los polifenoles en el crecimiento y viabilidad de las bacterias lácticas y en el metabolismo del ácido málico degradado, a veces, con resultados contradictorios. Aparentemente, los polifenoles pueden ejercer un efecto a veces estimulador y otras veces inhibidor sobre el crecimiento y actividad de las bacterias, dependiendo de la cepa y de la naturaleza y concentración de los polifenoles analizados. Por el momento, la información acerca de los mecanismos moleculares involucrados es muy poca.
Muchos estudios han confirmado el efecto estimulador del ácido gálico en el crecimiento de las cepas de O. oeni y en la velocidad con la que se degrada el ácido málico (Lombardi et al. 2012, Reguant et al. 2000 y Vivas et al. 1997).
Como en el caso de los ácidos hidroxicinámicos (García-Ruiz et al. 2009), en el 2003 Campos et al. demostraron que los ácidos p-cumárico y cafeico tienen un fuerte efecto inhibidor sobre las bacterias L. hilgardii Pediococcus pentosaceus. Los tres ácidos hidroxicinámicos (cafeico, ferúlico y p-cumárico) ejercen también efectos inhibidores sobre las bacterias O. oeni (Reguant et al. 2000).
Con respecto a los flavonoles, las opiniones son divergentes, pues algunos autores afirman que estos ejercen un efecto inhibidor (Cushnie y Lambert 2005), mientras otros dicen que ejercen un efecto estimulador (Reguant et al. 2000) sobre el crecimiento y la velocidad de degradación del ácido málico.
Parece ser también que la presencia de la catequina y la epicatequina, en las concentraciones que se observan generalmente en el vino, no tiene ningún efecto inhibidor en el crecimiento de O. oeni (entre 10 y 200 mg/L) (Lombardi et al. 2012). Incluso, la catequina estimularía el crecimiento de O. oeni y su efecto incrementaría cuanto mayor fuese su concentración en el vino (Reguant et al. 2000 y Alberto et al.2001).
Los taninos condensados serían muy tóxicos (Vivas et al. 2000), aun en concentraciones muy bajas, por debajo de los niveles normales del vino (0,5 g/L) (Figueiredo et al. 2007).
La presencia simultánea de moléculas que activan e inhiben el crecimiento, la viabilidad y la FML crea un balance que facilita, por lo general, el crecimiento de las bacterias lácticas. Asimismo, un gran número de taninos se polimerizan con otras moléculas, reduciendo así los efectos tóxicos. El arranque de la FML se hace aún más difícil con un vino que contenga esencialmente taninos poco polimerizados.
Recientemente, se han llevado a cabo ensayos con el fin de examinar el impacto de los extractos polifenólicos en la FML (Lonvaud-Funel 2013). Dichos extractos provienen de tres variedades de uva: merlot, cabernet sauvignon y tannat. Para cada extracto, se utilizaron 200 mL de vino; después de la evaporación a una temperatura de 30°C, los residuos obtenidos fueron resuspendidos en agua acidificada. La fracción polifenólica se midió tras la eliminación de azúcares y ácidos por medio de una purificación en columna. Al final, se añadieron los extractos a un vino chardonnay (etanol al 12,0%; pH de 3,5; SO2 total <20 mg/L) en concentraciones equivalentes a las concentraciones de polifenoles presentes inicialmente en el vino.
Los ensayos realizados con diferentes extractos demostraron que, en el caso de las dos cepas de O. oeni, el crecimiento bacteriano es inhibido al añadir extractos provenientes del cabernet sauvignon y del tannat (en la figura 6 se presentan los datos obtenidos con una de estas cepas). El resultado es una desaceleración significativa de la degradación del ácido málico. A pesar de que la FML se completó en 10 días con el vino chardonnay al que no se le agregaron extractos polifenólicos, había entre 1 y 1,5 g/L de ácido málico en el vino enriquecido con el extracto.

Figura 6: Cinéticas de fermentación maloláctica (concentración de ácido málico) en un vino chardonnay (testigo) y en el mismo vino tras la adición de extractos de cabernet sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y de tannat (T) (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

La adición de preparados de levaduras inactivadas –L1 y L2– en estos medios, se estudió con el fin de disminuir los efectos inhibidores en la FML.
Como se puede ver en las figuras 7 y 8, la FML fue estimulada en el vino chardonnay al que se le añadieron preparados de levaduras inactivadas con respecto al vino chardonnay testigo. De ello podemos concluir que dichos preparados contribuyen a la eliminación del efecto inhibidor asociado a la adición de extractos polifenólicos. Es posible que los preparados de levaduras inactivadas tengan una repercusión en diversos ámbitos, especialmente debida al enlace de los derivados de levaduras con los taninos, el cual reduce su toxicidad frente a las bacterias. La medición del potencial redox indica también que éste disminuye con la adición de dos nutrientes, lo cual contribuye a su vez a la estimulación del crecimiento bacteriano. Así pues, es evidente que estos activadores ayudan a enriquecer el perfil nutricional del vino y, asimismo, estimulan el crecimiento de las bacterias.
Figura 7: Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Cabernet Sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y en el mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 8: Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Tannat (T) y en el mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Los vinos tintos concentrados producidos durante las cosechas del 2012 y 2013 fueron sometidos a ensayos de adición de levaduras L1 inactivadas (ML Red Boost™).
En las figuras 9 y 10 se presentan los resultados de un vino tannat con las siguientes características: etanol al 14,6%, pH de 3,6, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L, índice total de polifenoles [ITP] igual a 90. A las tres cepas analizadas se les añadió la levadura ML Red Boost™ 24 horas antes de agregar las bacterias con el fin de aumentar la conductividad del medio para el crecimiento de O. oeni (disminuyendo la acción inhibidora de los taninos). El efecto de ello fue significativo en lo que respecta a la velocidad con la que las bacterias lácticas se desarrollaron. De hecho, ocho días después de la inoculación, la población bacteriana de las cepas A y B era 60% mayor en los medios tratados con el activador ML Red Boost™ que en los medios no tratados. En el caso de la cepa C, la diferencia era impresionante: el nivel de la población bacteriana en el vino tratado con el activador era 700 veces mayor que en el vino inoculado con las bacterias pero sin tratamiento activador. Dos semanas después de la inoculación, las diferencias del nivel de las poblaciones eran aún mayores, lo cual se traduce en duraciones de FML mucho más cortas en todos los medios a los que se les suministraron suplementos nutritivos (véase la figura 10).
Figura 9: Poblaciones bacterianas 8 y 14 días después de la inoculación con tres cepas de bacterias, con y sin adición del preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™ [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 10: Duración de la fermentación maloláctica con tres cepas de bacteria diferentes, con y sin adición del preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™ [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

CONCLUSIÓN
Aunque el mecanismo general de la fermentación maloláctica (FML) es bien conocido, la exploración específica del metabolismo de Oenococcus oeni no empezó sino recientemente y es ahora el tema de numerosos estudios. La creencia según la cual el ácido L-málico es suficiente para suplir las necesidades energéticas del desarrollo de O. oeni es aun difundida. No obstante, la verdad es otra. De hecho, las bacterias lácticas son microorganismos particularmente exigentes y tienen necesidades nutricionales complejas. La falta de ciertos nutrientes esenciales para la implantación, crecimiento y metabolismo de O. oeni pueden ocasionar un retraso e, incluso, el fracaso de la FML. Afortunadamente, existen soluciones a este problema. Las deficiencias nutricionales así como los inhibidores bacterianos varían de un medio a otro; su efecto negativo puede entonces limitarse añadiendo activadores de fermentación, cuya selección es diferente para los vinos blancos y para los tintos. Hemos descrito varios nutrientes específicos para los que se han optimizado diferentes formulaciones dependiendo de las aplicaciones y necesidades. Así, por ejemplo, el activador Opti’ML Blanc® fue concebido para estimular el crecimiento de determinadas bacterias y, por consiguiente, para reducir la duración de la FML, en los vinos blancos que se asocian a una FML difícil, como es el caso de algunos vinos chardonnay. Diseñado para los vinos tintos ricos en polifenoles, el activador ML Red Boost™, que debe ser añadido antes de la inoculación con  bacterias seleccionadas, contribuye a  la implantación de dichas bacterias en estos medios más hostiles.

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