10/2/15

EL DOMINIO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA:

Cómo controlar la nutrición de las bacterias enológicas y minimizar el efecto de los inhibidores
Magali Déleris-Bou, José María Heras y Sibylle Krieger-Weber
Lallemand SAS, Blagnac, Francia

INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo trataremos en detalle las necesidades de las bacterias enológicas en cuanto a fuentes de carbono y nutrientes que contienen nitrógeno, vitaminas y minerales. También se hará hincapié a que la carencia de ciertos elementos nutricionales en un mosto o en un vino puede tener una gran incidencia en la fermentación maloláctica (FML), por ello, es importante comprender dichas  necesidades  y conocer las herramientas de las que dispone el enólogo para lograr una FML sana y completa.

LAS BACTERIAS ENOLÓGICAS TIENEN UNAS NECESIDADES NUTRICIONALES COMPLEJAS

Metabolismo de los carbohidratos 
En el vino, los azúcares constituyen la principal fuente de energía para las bacterias lácticas desempeñando así un papel esencial en su crecimiento. Los principales azúcares del vino (hexosas) son la glucosa y la fructosa. Las bacterias lácticas son capaces de utilizar ambas fuentes, aunque Oenococcus oeni prefiere la fructosa, el metabolismo conjunto de la glucosa y la fructosa ofrece ventajas en términos de energía.
Al final de la fermentación alcohólica (FA), la concentración de glucosa-fructosa es baja, pero satisface aún las necesidades de las bacterias, pues la concentración bacteriana es igualmente baja. En efecto, la mayoría de bacterias lácticas son capaces de utilizar otros monosacáridos presentes en el vino (por ejemplo, la arabinosa, la manosa, la galactosa, la xilosa, etc.) al igual que los polisacáridos y los compuestos glicosilados. O. oeni posee una actividad glucosidasa extracelular (Guilloux-Benatier et al. 1993 y Guilloux-Benatier et al. 2000). Otros  estudios tales como los de Grimaldi et al. 2000, MacMahon et al. 1999 y Mansfield et al. 2002, han identificado esta actividad glucosidasa y hoy sabemos que un gran número de precursores aromáticos se conjugan con los residuos glucosídicos o con los disacáridos de glucosa. Estos compuestos aromáticos se liberan por la acción de las bacterias enológicas.

Metabolismo de los ácidos orgánicos
Los principales ácidos orgánicos presentes en el mosto de la uva y en el vino al final de la FA y transformados por Oenococcus oeni son los ácidos málico y cítrico.
Ácido málico. La concentración de ácido málico en el mosto depende del grado de madurez de la uva y varía entre 0,7 y 8,6 g/L (Cabanis y Cabanis 1998). La principal reacción en la FML es la descarboxilación del diácido L-málico del vino en monoácido L-láctico. En el caso del vino, el sistema maloláctico es un mecanismo que le permite a O. oeni recuperar energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) sintetizado y mantener un nivel de pH intracelular propicio para la actividad enzimática y el desarrollo celular.
El ácido málico penetra la célula en su forma aniónica para ser descarboxilado en ácido láctico en el citoplasma celular. La descarboxilación permite el consumo de un protón intracelular y la expulsión de protones por parte de los simportadores lactato/H+. Un gradiente de protones –o «fuerza motriz protónica»– del medio vínico hacia el interior de las células mantiene el pH intracelular de las bacterias (aproximadamente a 6,0) y conduce a la formación de energía en forma de ATP.
Ácido cítrico. El ácido cítrico, componente importante del mosto de la uva y del vino, tiene una concentración que oscila entre 0,1 y 0,7 g/L. La vía de degradación del ácido cítrico por parte de las bacterias lácticas provoca la formación de tres tipos de compuestos: ácido acético, lípidos y derivados acetoínicos (acetoína, butanodiol y diacetilo). El metabolismo del ácido cítrico es también una fuente de energía para O. oeni.
En general, el consumo de ácido cítrico comienza después del consumo de ácido málico. En el caso de O. oeni, el efecto de la cepa es de gran importancia en lo que se refiere al momento del ataque del citrato y de la velocidad con la que se consume el ácido cítrico. Mientras que ciertas cepas que producen altos niveles de diacetilo empiezan a consumir el ácido cítrico desde la mitad de la FML, otras cepas –de mayor interés para los enólogos ya que permiten evitar las notas mantecosas– no empiezan a metabolizar el ácido cítrico  hasta que ya no quede más ácido málico por consumir (Krieger 2012).

METABOLISMO DE LAS FUENTES DE NITRÓGENO
Los aminoácidos libres y los que provienen de la hidrólisis de los péptidos son las principales fuentes de nitrógeno para las bacterias enológicas. Contrariamente a las levaduras, los aminoácidos que necesitan las bacterias enológicas no pueden ser sintetizados a partir del nitrógeno amoniacal. Por consiguiente, los aminoácidos deben provenir del medio o ser sintetizados por las bacterias mediante los precursores  carboxílicos.

Aminoácidos
La necesidad de aminoácidos de las bacterias depende no solo de la especie sino también de la cepa. La identificación de los aminoácidos esenciales para O. oeni ha sido objeto de muchos estudios. La técnica preferida consiste en comparar el crecimiento bacteriano en un medio que contenga todos los aminoácidos necesarios (un medio completo) con las bacterias de otro medio que carezca de uno de dichos aminoácidos.
Las investigaciones de Garvie en 1967, de Fourcassié et al. en 1992, de Remize et al.en el 2006 y de Terrade et al. en el 2009 trataron las necesidades de nueve, seis, cinco y dos cepas de O. oeni, respectivamente. Las diferencias entre las metodologías utilizadas por los investigadores (por ejemplo, el medio de cultivo, las cepas utilizadas, la etapa de lavado de la biomasa, los trasplantes sucesivos, etc.) explican los diferentes resultados que se obtuvieron de estas investigaciones.
La siguiente tabla, adaptada del libro Les bactéries lactiques en œnologie de Alexandre et al., resume los resultados de estas investigaciones.
Dependiendo de cada caso, se dice que el aminoácido que falta en el medio de cultivo es:
  • Esencial, cuando la biomasa que se forma representa menos del 20% de la biomasa del cultivo testigo.
  • Necesario, cuando la biomasa que se forma representa entre el 20% y el 80% de la biomasa del cultivo testigo.
  • Indiferente, cuando la biomasa que se forma representa menos del 80% de la biomasa del cultivo testigo.

Tabla 1: Comparación de los aminoácidos necesarios para 22 cepas de Oenococcus oeni (adaptada de Les bactéries lactiques en œnologie de Alexandre et al.) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf ]

La arginina es un aminoácido esencial para las 22 cepas estudiadas. Así, aminoácidos como el ácido glutámico, la isoleucina, el triptófano, la metionina, la valina, la cisteína, la tirosina, la histidina y la fenilalanina son esenciales para el cultivo de la mayoría de cepas.
Por el contrario, la falta de prolina o de alanina en el medio no afecta al desarrollo de la mayoría de cepas, por lo cual, se consideran como aminoácidos indiferentes.
Los resultados que Remize et al. obtuvieron en el 2006 tras el estudio de dos cepas de O. oeni seleccionadas se presentan en las figuras 1 y 2.

Figura 1: Lalvin31®: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 2: Alpha™ MBR: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Los investigadores han estudiado también los requisitos de las cepas deLactobacillus. En Terrade et al. 2009, los autores concluyen que la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa de L. buchneri y una cepa de L. hilgardii es menor que la cantidad necesaria para dos cepas de O. oeni: cinco aminoácidos son esenciales para L. buchneri y ocho para L. hilgardii, en comparación con los 13 y 16 aminoácidos esenciales para las dos cepas de O. oeni.

Tabla 2: Nutrientes esenciales para cuatro cepas de bacterias enológicas (Terrade et al. 2009) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf ]

En la práctica, la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa es importante, pues esta indica que, en un medio que carezca de aminoácidos, las cepas deLactobacillus, que suelen ser indeseables, se desarrollaran más fácilmente que las cepas de O. oeni.
Péptidos
Además de los aminoácidos libres, los péptidos pueden constituir otra fuente de nitrógeno. Las bacterias enológicas tienen a la vez actividades proteolíticas (degradación de proteínas) y peptidolíticas (degradación de péptidos), y pueden obtener los aminoácidos necesarios o esenciales para su crecimiento gracias a los péptidos.
Las investigaciones acerca de la naturaleza del nitrógeno metabolizado por O. oenihan demostrado que la presencia de péptidos de levadura (fracciones entre 0,5 y 10 KDa) en el medio contribuyen sobre todo al desarrollo de O. oeni, en comparación con un medio que solo contiene aminoácidos libres (Remize et al. 2005). Asimismo, se ha demostrado que al metabolismo de los péptidos le sigue la liberación de aminoácidos libres hacia el medio.
Los péptidos parecen ser entonces la fuente de nitrógeno clave para el desarrollo deO. oeni. En términos de energía, las células bacterianas aprovechan el consumo de péptidos. En efecto, es bastante probable que ciertos péptidos estén más sujetos que otros a ser hidrolizados y transportados por las bacterias. Dichos péptidos son particularmente estimuladores puesto que permiten que se genere energía con una mayor productividad (Alexandre et al. 2008).
En la práctica, sabemos que en algunas variedades, como el chardonnay, resulta más difícil llevar a cabo la FML, aún en ausencia de factores inhibidores (por ejemplo, pH bajo, SO2 molecular alto), y se sospecha que la razón  sea una carencia de nutrientes esenciales. En el laboratorio de investigación y desarrollo de Lallemand, se han llevado a cabo ensayos para evaluar el impacto de la adición de varios péptidos a un vino chardonnay. Los resultados se obtuvieron después de haber adicionado un péptido considerado particularmente estimulador.
    Protocolo del experimento:
  • Medio: Vino blanco chardonnay (pH de 3,2, etanol  12,9%, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L)
  • Preparación de tres medios por cepa:
  • - Testigo: Vino sin ninguna adición
    - Vino + péptido a razón de 5 mg/L
    - Vino + péptido a razón de 20 mg/L
  • Inoculación en cada medio después  de la rehidratación de las bacterias MBR® A, B, C y D en agua no clorada durante 15 minutos, a 20°C
  • Incubación de las muestras de ensayo en recipientes de vidrio a 20°C
  • Seguimiento de la población bacteriana mediante su conteo en un medio MRS modificado.
La figura 3 presenta la población bacteriana siete días después de la inoculación. La adición de este péptido a razón de 5 mg/L al vino blanco chardonnay ejerce un efecto estimulador sobre el desarrollo de las cuatro cepas seleccionadas para el ensayo. Los estudios sobre O. oeni han demostrado que los aminoácidos ligados que son transportados al interior de la célula son  liberados y regresan al medio en su forma libre. Los péptidos, aunque fueron transportados, no son necesariamente consumidos (Ritt et al. 2008). La hipótesis propuesta era que dicho transporte se llevaba a cabo con el fin de ahorrar energía. En efecto,  parece que esta interiorización de aminoácidos ligados requiere menos energía que en el caso de los aminoácidos libres (Konings 2002 y Kunji et al. 1993), cuyo transporte puede realizarse por diferentes vías. Además, la excreción de aminoácidos libres por parte de los simportadores protónicos genera la fuerza protón- motriz  necesaria para la síntesis de ATP. Desde el punto de vista  energético, podría demostrarse que dicho péptido presenta una ventaja ya que mejora la resistencia de las bacterias en un medio ácido (pH de 3,2).

Figura 3: Impacto de la adición de un péptido con dos concentraciones diferentes (5 mg/L y 20 mg/L) al cultivo de cuatro cepas de bacteria Oenococcus oeni de un vino blanco chardonnay (Lallemand R & D) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

NECESIDADES EN VITAMINAS
Las bacterias lácticas necesitan varias vitaminas de la familia B, especialmente el ácido pantoténico (vitamina B5), la biotina (B8), la tiamina (B1) y la niacina (B3). Aunque la piridoxina (B6) y la riboflavina (B2) no son esenciales, estas también pueden contribuir al óptimo crecimiento de las cepas. El ácido pantoténico, presente en gran cantidad en el jugo de tomate al igual que en los jugos de uva y manzana, fue considerado por mucho tiempo como un factor de crecimiento especial para O. oeni y se encuentra en numerosos medios de cultivo de esta especie.
En un estudio realizado por Terrade et al. en el 2009, se demostró que la presencia de la niacina (B3) y del ácido pantoténico era esencial para el crecimiento de cuatro bacterias enológicas (dos O. oeni y dos Lactobacillus sp.), y que la riboflavina era solamente necesaria para dos bacterias Lactobacillus sp. La piridoxina (B6), por su parte, tenía un efecto estimulador en el cultivo de las cuatro cepas.

INFLUENCIA DE LOS MINERALES
Algunos minerales, como el magnesio, el manganeso, el potasio y el sodio son importantes bien porque son cofactores enzimáticos o bien porque intervienen en los mecanismos de transporte. Pocos estudios se han interesado en la necesidad de minerales de estas cepas.
Las bacterias enológicas tienen necesidades nutricionales múltiples y complejas, y el satisfacerlas contribuye al éxito de la FML. En consecuencia, cualquier carencia de estos elementos activadores del proceso de FML debe ser remediada con activadores específicos obtenidos a partir de levaduras inactivas específicas, las cuales son fuentes naturales de aminoácidos, péptidos, vitaminas y minerales, y son vitales para el crecimiento y la supervivencia de O. oeni.

ESTRATEGIAS PARA GARANTIZAR UNA FML COMPLETA
El vino es un medio no propicio para el desarrollo bacteriano
El vino constituye un medio estresante para las bacterias. Así pues, la acidez, el alcohol, los sulfitos y la temperatura (por debajo de 18°C) son factores que inhiben el crecimiento bacteriano. Además de ello, la levadura produce factores inhibidores durante la FA tales como el SO2, los ácidos grasos de cadena media y los péptidos. La carencia de nutrientes en el medio constituye también un factor inhibidor. Algunas prácticas en enología, como la clarificación, eliminan los nutrientes y las partículas en suspensión que favorecen el crecimiento bacteriano. Como se explicó antes, algunos aminoácidos son indispensables para el crecimiento de O. oeni. Hacia el final de la FA, el nivel de nitrógeno orgánico varía considerablemente de un vino a otro. Renouf (2013) ha publicado los resultados de su análisis con respecto al nivel de aminoácidos esenciales al final de la FA y antes de la FML en vinos de diversas varietdades (merlot, cabernet sauvignon, malbec, chardonnay, syrah, tannat y pinot noir) y de distintas denominaciones. Renouf expone las variaciones de los factores, clasificadas de 1 al 10, en el nivel total de aminoácidos vitales para el crecimiento deO. oeni. Lograr la FML completa fue particularmente difícil en el caso del vino con las mayores deficiencias.
Utilización de activadores de fermentación maloláctica
En general se considera que una buena FA depende de una cantidad suficiente de nutrientes para las levaduras y, asimismo, la FML necesita suficientes nutrientes para las bacterias. Hoy en día existen soluciones para lograr una FML completa.
La figura 4 presenta los resultados del análisis de ensayo realizado con un vino cabernet sauvignon (etanol  14% con un pH de 3,56; SO2 total <25 mg/L; SO2 libre de 5 mg/L), los cuales se encontraban dentro de los parámetros que se recomiendan para la bacteria Alpha MBR®.
Se compararon tres protocolos de FML:
  • Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR®
  • Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR® y adición del activador de fermentación Opti’Malo Plus® a razón de 20 g/hL
  • Vino testigo sin inoculación con bacterias específicas.
La temperatura de ensayo era de 18°C.
En el vino testigo, en el que no se inoculó ninguna bacteria seleccionada, la población bacteriana se mantuvo muy baja durante los 21 días del ensayo, sin llegar nunca a más de 1x104 UFC/mL. Con una población bacteriana tan baja, la concentración de ácido málico se mantuvo estable.
En el vino en el que se inocularon bacterias seleccionadas sin adición de ningún nutriente, la población bacteriana se mantuvo durante los primeros siete días tras la inoculación y luego empezó a disminuir paulatinamente. Diez días después de la inoculación, la muerte de las bacterias condujo al fin de la degradación del ácido málico.
Sin embargo, en el vino al que se le añadió el activador de FML se observó un crecimiento bacteriano rápido y continuo tras la inoculación. El ácido málico fue completamente metabolizado al cabo de 11 días. Este vino carecía probablemente de al menos un elemento esencial para el desarrollo de la bacteria Alpha.


Figura 4: Impacto de la adición de nutrientes para bacterias Opti'Malo Plus® en la fermentación maloláctica [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

El caso de los vinos blancos. Como ya se explicó, en el caso de los vinos blancos, especialmente del varietal chardonnay, el inicio de la FML se hace más difícil.
En un estudio de los vinos chardonnay, se analizaron los efectos de la inoculación con diversas cepas de bacteria y la adición de activadores de FML. Dicho estudio se centró en particular en los preparados de levaduras inactivas que contienen el activador peptídico cuyo efecto benéfico se muestra en la figura 1. Los resultados que se presentan en la figura 5 son un esbozo de las observaciones del estudio.
En el marco de esta investigación sobre el vino chardonnay, se compararon los siguientes protocolos:
  • Inoculación con la cepa de bacteria Alpha, Beta o PN4
  • Adición de un activador de FML a razón de 20 g/hL
  • Tipos de activadores: nutriente A (activador testigo) y un nuevo activador con un alto contenido en péptidos (Opti’ML Blanc®).
Dependiendo de la cepa utilizada, la FML sin adición de nutrientes puede durar entre 28 y 30 días. En este medio, muy probablemente con carencia de elementos esenciales para el crecimiento de las bacterias, el hecho de añadir un complejo de nutrientes rico en aminoácidos, péptidos y vitaminas reducirá ostensiblemente la duración de la FML, sea cual sea la cepa. Para las bacterias vínicas Alpha y Beta, el nuevo activador es más efectivo que el nutriente testigo.

Figura 5: Estudio sobre un nutriente para aplicación en chardonnay [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

El caso de los vinos tintos concentrados. En la práctica, lograr una FML con éxito también es difícil en los vinos tintos con altas concentraciones de polifenoles. Tal es el caso, por lo general, de los vinos merlot y tannat, del suroccidente de Francia, y del Graciano, de España.
Muchas investigaciones se han llevado a cabo con el fin de analizar la incidencia de los polifenoles en el crecimiento y viabilidad de las bacterias lácticas y en el metabolismo del ácido málico degradado, a veces, con resultados contradictorios. Aparentemente, los polifenoles pueden ejercer un efecto a veces estimulador y otras veces inhibidor sobre el crecimiento y actividad de las bacterias, dependiendo de la cepa y de la naturaleza y concentración de los polifenoles analizados. Por el momento, la información acerca de los mecanismos moleculares involucrados es muy poca.
Muchos estudios han confirmado el efecto estimulador del ácido gálico en el crecimiento de las cepas de O. oeni y en la velocidad con la que se degrada el ácido málico (Lombardi et al. 2012, Reguant et al. 2000 y Vivas et al. 1997).
Como en el caso de los ácidos hidroxicinámicos (García-Ruiz et al. 2009), en el 2003 Campos et al. demostraron que los ácidos p-cumárico y cafeico tienen un fuerte efecto inhibidor sobre las bacterias L. hilgardii Pediococcus pentosaceus. Los tres ácidos hidroxicinámicos (cafeico, ferúlico y p-cumárico) ejercen también efectos inhibidores sobre las bacterias O. oeni (Reguant et al. 2000).
Con respecto a los flavonoles, las opiniones son divergentes, pues algunos autores afirman que estos ejercen un efecto inhibidor (Cushnie y Lambert 2005), mientras otros dicen que ejercen un efecto estimulador (Reguant et al. 2000) sobre el crecimiento y la velocidad de degradación del ácido málico.
Parece ser también que la presencia de la catequina y la epicatequina, en las concentraciones que se observan generalmente en el vino, no tiene ningún efecto inhibidor en el crecimiento de O. oeni (entre 10 y 200 mg/L) (Lombardi et al. 2012). Incluso, la catequina estimularía el crecimiento de O. oeni y su efecto incrementaría cuanto mayor fuese su concentración en el vino (Reguant et al. 2000 y Alberto et al.2001).
Los taninos condensados serían muy tóxicos (Vivas et al. 2000), aun en concentraciones muy bajas, por debajo de los niveles normales del vino (0,5 g/L) (Figueiredo et al. 2007).
La presencia simultánea de moléculas que activan e inhiben el crecimiento, la viabilidad y la FML crea un balance que facilita, por lo general, el crecimiento de las bacterias lácticas. Asimismo, un gran número de taninos se polimerizan con otras moléculas, reduciendo así los efectos tóxicos. El arranque de la FML se hace aún más difícil con un vino que contenga esencialmente taninos poco polimerizados.
Recientemente, se han llevado a cabo ensayos con el fin de examinar el impacto de los extractos polifenólicos en la FML (Lonvaud-Funel 2013). Dichos extractos provienen de tres variedades de uva: merlot, cabernet sauvignon y tannat. Para cada extracto, se utilizaron 200 mL de vino; después de la evaporación a una temperatura de 30°C, los residuos obtenidos fueron resuspendidos en agua acidificada. La fracción polifenólica se midió tras la eliminación de azúcares y ácidos por medio de una purificación en columna. Al final, se añadieron los extractos a un vino chardonnay (etanol al 12,0%; pH de 3,5; SO2 total <20 mg/L) en concentraciones equivalentes a las concentraciones de polifenoles presentes inicialmente en el vino.
Los ensayos realizados con diferentes extractos demostraron que, en el caso de las dos cepas de O. oeni, el crecimiento bacteriano es inhibido al añadir extractos provenientes del cabernet sauvignon y del tannat (en la figura 6 se presentan los datos obtenidos con una de estas cepas). El resultado es una desaceleración significativa de la degradación del ácido málico. A pesar de que la FML se completó en 10 días con el vino chardonnay al que no se le agregaron extractos polifenólicos, había entre 1 y 1,5 g/L de ácido málico en el vino enriquecido con el extracto.

Figura 6: Cinéticas de fermentación maloláctica (concentración de ácido málico) en un vino chardonnay (testigo) y en el mismo vino tras la adición de extractos de cabernet sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y de tannat (T) (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

La adición de preparados de levaduras inactivadas –L1 y L2– en estos medios, se estudió con el fin de disminuir los efectos inhibidores en la FML.
Como se puede ver en las figuras 7 y 8, la FML fue estimulada en el vino chardonnay al que se le añadieron preparados de levaduras inactivadas con respecto al vino chardonnay testigo. De ello podemos concluir que dichos preparados contribuyen a la eliminación del efecto inhibidor asociado a la adición de extractos polifenólicos. Es posible que los preparados de levaduras inactivadas tengan una repercusión en diversos ámbitos, especialmente debida al enlace de los derivados de levaduras con los taninos, el cual reduce su toxicidad frente a las bacterias. La medición del potencial redox indica también que éste disminuye con la adición de dos nutrientes, lo cual contribuye a su vez a la estimulación del crecimiento bacteriano. Así pues, es evidente que estos activadores ayudan a enriquecer el perfil nutricional del vino y, asimismo, estimulan el crecimiento de las bacterias.
Figura 7: Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Cabernet Sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y en el mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 8: Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Tannat (T) y en el mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel, 2013) [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Los vinos tintos concentrados producidos durante las cosechas del 2012 y 2013 fueron sometidos a ensayos de adición de levaduras L1 inactivadas (ML Red Boost™).
En las figuras 9 y 10 se presentan los resultados de un vino tannat con las siguientes características: etanol al 14,6%, pH de 3,6, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L, índice total de polifenoles [ITP] igual a 90. A las tres cepas analizadas se les añadió la levadura ML Red Boost™ 24 horas antes de agregar las bacterias con el fin de aumentar la conductividad del medio para el crecimiento de O. oeni (disminuyendo la acción inhibidora de los taninos). El efecto de ello fue significativo en lo que respecta a la velocidad con la que las bacterias lácticas se desarrollaron. De hecho, ocho días después de la inoculación, la población bacteriana de las cepas A y B era 60% mayor en los medios tratados con el activador ML Red Boost™ que en los medios no tratados. En el caso de la cepa C, la diferencia era impresionante: el nivel de la población bacteriana en el vino tratado con el activador era 700 veces mayor que en el vino inoculado con las bacterias pero sin tratamiento activador. Dos semanas después de la inoculación, las diferencias del nivel de las poblaciones eran aún mayores, lo cual se traduce en duraciones de FML mucho más cortas en todos los medios a los que se les suministraron suplementos nutritivos (véase la figura 10).
Figura 9: Poblaciones bacterianas 8 y 14 días después de la inoculación con tres cepas de bacterias, con y sin adición del preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™ [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

Figura 10: Duración de la fermentación maloláctica con tres cepas de bacteria diferentes, con y sin adición del preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™ [Clique aquí para ampliar vista en artículo en pdf]

CONCLUSIÓN
Aunque el mecanismo general de la fermentación maloláctica (FML) es bien conocido, la exploración específica del metabolismo de Oenococcus oeni no empezó sino recientemente y es ahora el tema de numerosos estudios. La creencia según la cual el ácido L-málico es suficiente para suplir las necesidades energéticas del desarrollo de O. oeni es aun difundida. No obstante, la verdad es otra. De hecho, las bacterias lácticas son microorganismos particularmente exigentes y tienen necesidades nutricionales complejas. La falta de ciertos nutrientes esenciales para la implantación, crecimiento y metabolismo de O. oeni pueden ocasionar un retraso e, incluso, el fracaso de la FML. Afortunadamente, existen soluciones a este problema. Las deficiencias nutricionales así como los inhibidores bacterianos varían de un medio a otro; su efecto negativo puede entonces limitarse añadiendo activadores de fermentación, cuya selección es diferente para los vinos blancos y para los tintos. Hemos descrito varios nutrientes específicos para los que se han optimizado diferentes formulaciones dependiendo de las aplicaciones y necesidades. Así, por ejemplo, el activador Opti’ML Blanc® fue concebido para estimular el crecimiento de determinadas bacterias y, por consiguiente, para reducir la duración de la FML, en los vinos blancos que se asocian a una FML difícil, como es el caso de algunos vinos chardonnay. Diseñado para los vinos tintos ricos en polifenoles, el activador ML Red Boost™, que debe ser añadido antes de la inoculación con  bacterias seleccionadas, contribuye a  la implantación de dichas bacterias en estos medios más hostiles.

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