23/3/15

Métodos independientes y dependientes de cultivo para estudiar y caracterizar la ecología microbiana en la fermentación vínica


Luca Cocolin, Paola Dolci y Kalliopi Rantsiou 
Departamento de Valorización y Protección de Recursos Agroforestales,
Sección de Microbiología Agraria y Tecnología Alimentaria,
Facultad de Agrarias, Universidad de Turín, Grugliasco, Turín, Italia

La fermentación vínica es un complejo ecosistema microbiano, en el que tanto
levaduras como bacterias están tomando parte del proceso de transformación con
sus actividades metabólicas.
Los tradicionales métodos microbiológicos no permiten una comprensión completa
de la ecología microbiana de estos sistemas complejos. Esto se debe principalmente
a la capacidad de ciertos microorganismos de crecer en medios microbiológicos 
preferentemente con respecto a otros.
Además, con estos métodos, las células con estrés o dañadas no pueden ser detectados
en las placas. En los últimos 10 años se han desarrollado nuevos métodos basados en el
análisis de los ácidos nucleicos (DNA y RNA) que se extraen directamente de la muestra
sin necesidad de cultivo microbiano. El método que se utiliza a menudo en este tipo de
estudios es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), junto con la desnaturalización 
de electroforesis en gel de gradiente (DGGE).
Por otra parte, el desarrollo de herramientas moleculares para la caracterización de las
cepas aisladas en la fermentación del vino permite una mejor comprensión de la dinámica
de las cepas y la predominancia de unas u otras. El objetivo de este trabajo es mostrar las 
contribuciones más importantes al estudio de la ecología durante la fermentación vínica 
mediante el uso de herramientas moleculares, como la PCR-DGGE, para la caracterización
de cepas.

Introducción
En las fermentaciones del vino conviven diferentes especies de levaduras, bacterias y
hongos filamentosos. En cuanto a las levaduras, las principales responsables de la 
fermentación alcohólica pertenecen al género Saccharomyces (en particular la especie
S. cerevisiae), mientras que las bacterias del ácido láctico o bacterias lácticas (BL) son 
las responsables de la fermentación maloláctica (Fleet, 1993). Dado que sus actividades
metabólicas impulsan la transformación del mosto de uva al vino, es esencial comprender
el comportamiento de los microorganismos durante la fermentación con el fin de obtener 
productos finales con las características organolépticas deseadas. 
Más concretamente, tras el desarrollo de microorganismos indeseables, se obtienen vinos
con alta acidez volátil, sabores desagradables y con turbidez, debido al desarrollo de bacterias
productoras de exopolisacáridos (Comi et al., 2006).
La dinámica microbiana de levaduras y bacterias se estudia desde los años 1970 (Barnett et al., 1972). Mediante el uso de los métodos clásicos, se realizan recuentos de microorganismos y se determina su diversidad en medios sintéticos con agar, pero en algunos casos se requiere un período de incubación en medio líquido, para promover el crecimiento de microorganismos específicos o seleccionarlos, ya que su aislamiento sería imposible sin este paso. El gran inconveniente de los métodos microbiológicos clásicos dependientes de cultivo es la imposibilidad de llegar a tener una visión precisa de la biodiversidad de estos ecosistemas complejos. Al utilizar los métodos de enriquecimiento y crecimiento en medios microbiológicos, la microbiota originalmente presente en la muestra es sometida a importantes cambios debido a la capacidad de ciertas especies para dominar el entorno y superar a los otros componentes microbianos. Por esta razón la población numéricamente menos importante, o en condiciones de estrés, apenas es recuperada e identificada. Con los métodos dependientes de cultivo hay un alto riesgo de errores de identificación de la ecología de los complejos ecosistemas microbianos (Hugenholtz et al., 1998).
A finales de los años 1990, los enfoques moleculares abrieron nuevas fronteras en la comprensión de la ecología microbiana. Estos métodos, llamados habitualmente como independientes de cultivo, son capaces de detectar e identificar microorganismos directamente en el sistema sin cultivarlos ni aislarlos, ya que analizan su DNA o RNA. Su novedad se basa en la extracción de los ácidos nucleicos directamente de las matrices, los cuales posteriormente son analizados por métodos capaces de poner de relieve la diversidad microbiana. Estudiando el DNA, es posible definir cuántas y cuáles son las especies microbianas presentes en una muestra específica, mientras que el estudio del RNA permite entender cuál es la parte metabólicamente activa de la población. Éste es un aspecto muy relevante en el caso de los alimentos fermentados, como el vino, donde es necesario estudiar las especies que son responsables de la transformación. Uno de los métodos independientes de cultivo más populares y más a menudo utilizado por los investigadores es la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la PCR-DGGE, los ácidos nucleicos son sometidos a amplificación con cebadores universales, que son capaces de amplificar, en teoría, todo el DNA o el RNA de bacterias y levaduras presentes en un ecosistema específico. Después de la PCR, el amplicón estará constituido por una mezcla de diferentes productos de amplificación, que son más heterogéneas si la diversidad biológica en la muestra es compleja. Las secuencias de nucleótidos amplificados se separarán posteriormente con una electroforesis en un gel de poliacrilamida con un gradiente químico de los desnaturalizantes (urea y formamida). Cuando las moléculas de DNA encuentran el gradiente desnaturalizante capaz de abrir parcialmente (desnaturalizar) la doble hélice, se produce un cambio en la movilidad electroforética de la molécula, que en un momento dado hará que se detenga por completo en el gel. Dado que la desnaturalización del DNA depende de su secuencia, las diferentes moléculas de DNA tendrán una movilidad electroforética diferente. Con este enfoque entonces es posible diferenciar los microorganismos presentes en el mismo ecosistema, siempre y cuando presenten regiones de amplificación con secuencias diferentes. Para las fermentaciones alcohólica y maloláctica, diversos estudios han puesto de relieve que para las levaduras el bucle D1-D2 del gen del RNAr 26S (Cocolin et al., 2000) (fig. 1) y la región V7-V8 del gen del RNAr 16S de bacterias (López et al., 2003) son óptimas para ser utilizadas en el estudio de la ecología microbiana durante la vinificación.

Figura 1A. Perfiles DGGE obtenidos de cepas tipo de levaduras. Para la amplificación se utilizaron los cebadores NL1-NL2 (Cocolin et al., 2000) y las condiciones desnaturalizantes fueron de 30 a 60%. La electroforesis se hizo a 120V durante 4 h a 60ºC. Carriles: 1:Candida stellata DBVPG6714T2: Pichia anomala DBVPG6612T3Kluyveromyces thermotollerans DBVPG6480T4: Hanseniaspora uvarum DBVPG6717T5:Saccharomyces cerevisiae DBVPG6173T6: Brettanomyces bruxellensis DBVPG6707T7:Brettanomyces anomalus NCAIM637T. DBVPG: Dipartimento di Biologia Vegetale, Università di Perugia, Italia; NCAIM, National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Szant Istvan University, Budapest, Hungría.
Figura 1B. Perfiles DGGE obtenidos de cepas tipo de levaduras, y mosto al inicio de fermentación. Para la amplificación se utilizaron los cebadores NL1-NL2 (Cocolin et al., 2000) y las condiciones desnaturalizantes fueron de 30 a 60%. La electroforesis se hizo a 120V durante 4 h a 60ºC. Carriles: 1Kluyveromyces thermotollerans DBVPG6480T2:Hanseniaspora uvarum DBVPG6717T3Saccharomyces cerevisiae DBVPG6173T4:Brettanomyces bruxellensis DBVPG6707T5: muestra de mosto al inicio de fermentación.

El desarrollo de métodos moleculares ha permitido también la diferenciación y caracterización de las cepas aisladas durante la fermentación. Ésta es una información importante en la que los investigadores están interesados porque puede dar una idea de la dinámica de cepas durante las fermentaciones. Mediante el uso de métodos moleculares de caracterización o tipificación es posible por ejemplo definir qué cepa es capaz de llevar a cabo la fermentación y en el caso de la adición de cultivos iniciadores, definir si la cepa inoculada será capaz de hacerse cargo del proceso y convertirse en la cepa dominante.
En este trabajo se presentan algunos ejemplos de métodos moleculares independientes de cultivo, así como de tipificación de los microorganismos aislados de la fermentación vínica.
PCR-DGGE en la fermentación vínica
La PCR-DGGE es uno de los métodos más frecuentemente utilizados para la definición de la ecología microbiana en la fermentación del vino. El primer estudio que utilizó PCR-DGGE en este sector fue publicado por Cocolin et al. (2000). En él se estudió la dinámica microbiana de levaduras enológicas, como SaccharomycescerevisiaeMetschikowia pulcherrimaCandida ethanolica y Kloekera apiculata a lo largo de fermentaciones de laboratorio. Un aspecto importante resaltado en este estudio fue la posibilidad de controlar las poblaciones de otras especies de levadura que fueran al menos 0,01% con respecto a la Saccharomyces dominante, definiendo de esta manera el límite de sensibilidad del método. El protocolo se utilizó para estudiar la ecología de levaduras durante la fermentación comercial de un vino dulce, elaborado a partir de uvas deliberadamente infectadas con Botrytiscinerea. Se identificaron varias levaduras no-Saccharomyces, tales comoMetschnikowia sp. y Pichia anomala (Cocolin et al., 2001b). Además, se observó a lo largo de la fermentación una traza constante de una especie de Candida. A raíz de los estudios de la fermentación del mencionado vino dulce, se observó que el perfil molecular de varias especies de levadura estaba presente en los geles de DGGE geles incluso cuando sus colonias no eran visibles en los medios de cultivo de agar (Mills et al. 2002). Este aspecto fue particularmente importante para una especie de Candida, posteriormente identificada como C. zemplinina (Sipiczki, 2003). Teniendo también en cuenta los resultados de dot blot de RNA obtenidos en este estudio, fue posible demostrar que las células metabólicamente activas, aunque no cultivables, podrían estar presentes durante la fermentación alcohólica. Después de estas primeras aplicaciones, la PCR-DGGE fue usada extensivamente para estudios de enología. Cocolin et al. (2002) lo utilizaron para controlar fermentaciones continuas, donde se destacó la presencia de no-Saccharomycessolamente en la etapa inicial de puesta a punto del fermentador, mientras que durante el resto del proceso, Saccharomyces fue el único microorganismo detectado en los geles. Renouf et al. (2006a) utilizaron el DGGE para seguir la ecología de tres bodegas francesas durante la fermentación alcohólica y la maloláctica. En los tres casos se pudo detectar la presencia constante de Brettanomyces bruxellensis, una de las levaduras enológicas más controvertidas, capaz de persistir en el vino acabado.
Mientras que la PCR-DGGE ha sido un método frecuentemente utilizado para estudiar la ecología de levaduras, sólo unos pocos estudios han sido publicados sobre la ecología bacteriana durante la elaboración del vino. Un problema importante que había que resolver era la no-especificidad de los cebadores utilizados para amplificar los DNA bacterianos. Como fué demostrado por López et al. (2003), varios cebadores específicos "bacterianos" también amplificaban DNA de levaduras, mohos y plantas. Un cuidadoso estudio de las secuencias de los genes ribosomales dió como resultado la definición de cebadores altamente específicos para bacterias, que podrían ser utilizados para el análisis de DGGE. Además, se han utilizado otras dianas de amplificación con el mismo propósito. La subunidad β de la RNA polimerasa (rpoB) se ha propuesto como gen alternativo al utilizar el DGGE (Dahllofet al., 2000). En concreto, Renouf et al. (2006b) utilizaron cebadores para la rpoBpara estudiar la ecología bacteriana en diferentes bodegas. Este trabajo puso de relieve que se detectaron diferencias en la ecología bacteriana sólo al inicio de la fermentación maloláctica, mientras que al final solamente estaba presenteOenococcus oeni. Por último, en 2008, Urso et al., publicaron un artículo sobre la ecología de levaduras durante la fermentación de un vino dulce en Italia, con uvas secadas de forma natural en la planta. El comienzo de la fermentación fue dominado por hongos filamentosos, tanto a nivel de DNA como de RNA, pero después del estrujado, en el mosto, las levaduras, como Kloeckera y Candida, seguidas por S. cerevisiae, fueron capaces de dominar la fermentación.
Caracterización molecular de las cepas de levadura aisladas durante la vinificación
Un campo importante de investigación, dirigido a aclarar la compleja interacción de levaduras y bacterias durante la fermentación del vino, es la caracterización molecular de las especies aisladas durante el proceso de transformación. En los últimos 20 años se han propuesto varios métodos y la literatura está llena de trabajos que describen el uso de estos métodos para diferenciar cepas de la misma especie. La electroforesis de campo pulsante (PFGE), el análisis de restricción del DNA mitocondrial, el DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD), la Sau-PCR (con el enzima de restricción Sau3A) y los minisatélites son los métodos de caracterización más utilizados en estudios de ecología durante la fermentación vínica. Estos métodos se combinaron en un estudio publicado por Cocolin et al. (2004), con el fin de investigar la diferencia genética entre los aislados de S. cerevisiae en bodegas modernas y antiguas. Mediante el uso de RAPD, PFGE y Sau-PCR, fue posible diferenciar las cepas estudiadas en función de su lugar de aislamiento (fig. 2). Por otra parte, con el complemento de análisis fisiológicos, se demostró que las cepas aisladas de las bodegas modernas habían modificado caracteres específicos bajo la presión del medio ambiente bodega (efecto bodega). La técnica de amplificación RAPD también ha sido recientemente utilizada por Romano et al. (2008) para investigar la biodiversidad de cepas silvestres de S. cerevisiae, y optimizar la calidad del vino (Figura 3). Además por otra parte, Urso et al. (2008) fueron capaces de seguir la dinámica de cepas de S. cerevisiae durante la fermentación de vinos dulces inoculados con cultivos iniciadores específicos. Se comprobó que en un caso, el cultivo iniciador no fue capaz de realizar la transformación, que estaba dominada por cepas silvestres procedentes de la uva utilizada.

Figura 2. Caracterización molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de fermentaciones vínicas espontáneas. A: RAPD-PCR; B: Sau-PCR; C: PFGE.


Figura 3. Dendrograma con agrupaciones de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de fermentaciones vínicas naturales, en base a sus perfiles RAPD.

Conclusiones
El desarrollo tecnológico y los avances científicos en el campo de la biología molecular han llevado a la creación de instrumentos de análisis cada vez más precisos y exactos para el estudio de sistemas microbianos complejos. La aplicación de este enfoque permite una mejor comprensión de los procesos microbianos, que previamente habían sido caracterizados por los métodos tradicionales de cultivo, pero no aclarados por completo. Mediante el uso de métodos independientes de cultivo y la caracterización molecular de las cepas aisladas, ha sido posible una mejor comprensión de esta compleja transformación. Es importante destacar que la posible presencia de células viables pero no cultivables, especialmente en el caso de la levadura contaminante Brettanomyces bruxellensis, debe ser cuidadosamente evaluada debido a la conexión directa de estos microorganismos y sus actividades metabólicas con la calidad organoléptica del producto final.
El uso de métodos moleculares en las fermentaciones vínicas ha permitido un conocimiento más profundo de las interacciones entre diferentes especies de levaduras y entre éstas y las bacterias, de manera que se pueden prever posibles intervenciones, con el fin de controlar el proceso y obtener un vino con óptimas características organolépticas y sensoriales.

Bibliografía
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11/3/15

Desarrollo de cepas dianas de levadura para la industria vínica


Ricardo Cordero
Grupo de Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología,
Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili (URV), Tarragona
El mayor progreso en biotecnología microbiana enológica de los últimos años ha sido hecho en el desarrollo de nuevas cepas vínicas de levadura. Sin embargo, dos décadas después del lanzamiento de la primera levadura genéticamente modificada para uso industrial, la industria enológica entra en el tercer milenio sin contar con una levadura vínica genéticamente modificada lo suficientemente robusta para su uso a escala industrial. Aspectos económicos, comerciales, técnicos, científicos, legales y sociales condicionan el uso de levaduras vínicas transgénicas. Siendo tantas las variables implicadas en este problema, resultaría naíf defender el desarrollo de cepas vínicas genéticamente modificadas desde un punto de vista puramente comercial. Sin embargo la vasta información científica y las plataformas tecnológicas que actualmente existen para el estudio de cepas de la levaduraSaccharomyces cerevisiae de laboratorio pueden utilizarse para la comprensión de genomas más complejos como los de las cepas industriales, permitiendo de esta manera una comprensión de la dinámica diferencial de los genomas de las diferentes cepas de levaduras vínicas –silvestre o genéticamente modificadas– durante la fermentación alcohólica.
Cepas genéticamente modificadas de uso industrial
El desarrollo de cepas de organismos genéticamente modificados para uso industrial (con su concomitante evaluación a escala industrial) es el único camino que permite la validación de las observaciones obtenidas en estudios precedentes. Estas cepas de nueva generación deberán ser sometidas a sofisticados y costosos peritajes, ya reglamentados en algunos países, para su posible uso en la industria como organismos genéticamente modificados (OGM), al margen de sus reconocidos aspectos particulares provechosos tanto para el productor como para el consumidor de vino. Finalmente en trabajo conjunto con los defensores del tradicionalismo y los consumidores alarmistas, deberá superarse el último y, quizá, más difícil desafío: la construcción de una imagen más equilibrada de los riesgos y beneficios de este tipo de productos. La evaluación de las cepas de levaduras genéticamente modificadas se verá facilitada gracias al conocimiento actual del genoma, proteoma y metaboloma de varias cepas vínicas comerciales, permitiendo demostrar su no-toxicidad.
La técnica de hibridación entre cepas diferentes con relevantes caracteres para el productor de vino es la más popular para la obtención de nuevas cepas vínicas comerciales. Las cepas de levadura desarrolladas por técnicas de modificación genética sólo encuentran su esplendor en la industria farmacéutica global, ya que en el sector de alimentos fermentados muchos países prohíben el uso de cepas genéticamente modificadas.
En la actualidad sólo dos cepas vínicas de la levadura S. cerevisiae genéticamente modificadas por la técnica del DNA recombinante han obtenido el estatus GRAS (Generally Regarded As Safe) por parte de la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos, autorizándose así su comercialización. La primera de estas cepas es la «cepa maloláctica» ML01, que expresa en el locus URA3 los genes codificantes para la malato permeasa (mae1) de Schizosaccharomyces pombe, y la enzima maloláctica (mleA) de Oenococcus oeni, ambos bajo las secuencias reguladoras del gen PGK1 de S. cerevisiae.1 Esta cepa genéticamente modificada cuenta con la capacidad de realizar la fermentación maloláctica al mismo tiempo que ocurre la fermentación alcohólica (fig. 1).

Figura 1. Evolución de las fermentaciones de mosto chardonnay realizadas con la cepa genéticamente modificada ML01 y la cepa de referencia silvestre S92

ECMo01 es la segunda de las cepas que obtuvo el estatus GRAS. En ella se sobreexpresan los genes propios de S. cerevisiae DUR1 y DUR2, que codifican para dos enzimas ATP-urea amidoliasas por medio del reemplazo de las secuencias reguladoras nativas de estos genes por las del gen PGK1. El supuesto compuesto cancerígeno etil carbamato (uretano) se forma espontáneamente en el vino por la combinación entre urea y etanol. La actividad de la cepa ECMo01 reduce los niveles de urea libre en el vino, reduciendo indirectamente, por disminución de uno de los reactivos, la formación de etil carbamato en el vino.2
La bibliografía especializada da cuenta de otras cepas vínicas genéticamente modificadas para la producción de enzimas con actividad carbohidrasa similares a las utilizadas en las preparaciones comerciales (pectinasas, células y hemicelulasas) para el mejoramiento de procesos como la filtración o la extracción de color. La levadura S. cervisiae cuenta con actividad polisacarasa muy limitada, por lo que la expresión heteróloga de genes que codifican polisacarasas específicas en las cepas vínicas de levadura ayudaría a mejorar algunos de los pasos del proceso de vinificación. Si el enólogo pudiera contar con estas levaduras genéticamente modificadas evitaría el uso de costosas preparaciones enzimáticas comerciales con actividades secundarias impredecibles para el productor. Louw et al.3 generaron una cepa de S. cerevisiae que expresa los genes XYN2 que codifican para una xilanasa de Trichoderma reesei y end1 codante para la endoglucanasa de Butyvibrio fibriosolvens. En la comparación de los vinos producidos con la cepa genéticamente modificada respecto a los de la cepa de referencia silvestre no se detectaron variaciones significativas en los parámetros químicos resultantes de la fermentación alcohólica, los primeros presentaron un color más intenso, y algunos de ellos obtuvieron mejores calificaciones por parte de un panel de catadores.

Cepas con mayor capacidad pectinasa
Muchas son las tácticas desarrolladas usando genes de diferente origen microbiano para incrementar la capacidad pectinasa de la levadura S. cerevisiae. Teniendo en consideración que algunas cepas de levadura cuentan con actividad PG debido a la presencia de un único gen (PGU1), el incremento de la actividad transcripcional del mismo debería verse reflejado en un incremento de actividad poligalacturonasa (PG) por parte de la cepa. Este cambio transcripcional fue abordado desde estrategias diferentes tales como: mutaciones en el gen de estructura PGU1, cambios en las vías metabólicas de regulación de la secuencia promotora del gen y el reemplazo de las secuencias de regulación nativas del gen PGU1 por otras más potentes.
Esta última fue ensayada en colaboración científica por los profesores Isabel Briones y Ricardo Cordero.4 La técnica para crear esta cepa recombinante se basó en el uso de secuencias de DNA propias de S. cerevisia, y el cassette de expresión se integró en el genoma para lograr una mayor estabilidad genética sin tener que utilizar compuestos químicos que forzaran la estabilidad del mismo durante el proceso de vinificación. El cassette de expresión estaba formado por el gen PGU1 en fusión transcripcional con la secuencia promotora del gen PGK1. Este cassette de expresión fue integrado en el alelo mutado de ilv2 de la cepa vínica UCLMS-1M, que codifica para la acetolactato sintetasa que provee resistencia al herbicida sulfometurón-metil. La reparación de este alelo por parte del cassette de expresión fue utilizada como marcador de selección positiva para la obtención de la cepa genéticamente modificada UCLMS-1M que presenta actividad poligalacturonasa (fig. 2). Se obtuvo así una nueva cepa vínica que no presenta DNA bacteriano, y que cumple con la normativa para OGM de Estados Unidos y Europa. La patente de esta cepa fue registrada el primero de julio del 2003 en España, y publicada con el número de registro WO/2004/00519. Los vinos obtenidos a partir de fermentaciones llevadas a cabo con esta cepa genéticamente modificada presentaron perfiles aromáticos y palativos similares a los realizados con la cepa de referencia UCLMS-1. Los vinos tintos producidos con la cepa genéticamente modificada incrementan un 7 % de zumo obtenido a partir del prensado del hollejo generando vinos de color más intenso y más fáciles de filtrar.

Figura 2. Los halos claros en la placa de la derecha representan la actividad poligalacturonasa de la cepa UCLMS-1M, diferenciándose de las colonias de la placa de la izquierda donde se inoculó la cepa de referencia UCLMS-1

Perspectivas
Los avances recientes en citología, bioquímica, química y biología molecular permiten entender los cambios metabólicos que realiza S. cerevisiae durante la fermentación alcohólica y el impacto de su metabolismo en el producto final. Asimismo, estas plataformas tecnológicas facilitan el análisis del vino producido por las cepas de levaduras genéticamente modificadas, cumpliéndose así con las exigencias del productor y del consumidor exigente. Estoy persuadido que la máxima transparencia en este tipo de evaluaciones permitirá que las cepas de levadura genéticamente modificadas encuentren su lugar como herramientas biotecnológicas microbianas para el productor y como certificado de vinos de buena calidad para los consumidores de vino.

Bibliografía
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2 Coulon J, Husnik JI, Inglis DL, van der Merwe GK, Lonvaud A, Erasmus DJ, van Vuuren HJJ: «Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae to minimize the production of ethyl carbamate in wine». American Journal of Enology and Viticulture 2006; 57: 113-24.
3 Louw CT, Pretorius IS, van Rensburg P: «The effect of polysaccharide-degrading wine yeast transformants on the efficiency of wine processing and wine flavour». Journal of Biotechnology 2006; 125: 447-461.
4 Fernández-González M, Úbeda JF, Cordero-Otero RR, Thanvanthri Gururajan V, Briones AI: «Engineering of an oenological Saccharomyces cerevisiae strain with pectinolytic activity and its effect on wine». International Journal of Food Microbiology 2005; 102: 173-183

2/3/15

Enfoques genómicos, posgenómicos y genéticos para desvelar las propiedades de las levaduras


Bruno Blondin
Prof. Montpellier SupAgro
UMR 1083 Sciences pour l’œnologie. Montpellier SupAgro,
INRA-UM1, Microbiologie, Montpellier, Francia

Las levaduras enológicas no deberían guardar sus secretos por mucho tiempo más. Los progresos realizados desde la llegada de la biología molecular en los años ochenta han llevado a un arsenal de herramientas y enfoques que permiten a los microbiólogos de hoy día abordar problemas considerados durante mucho tiempo como inaccesibles. A raíz de los conocimientos surgidos del análisis de los genomas, han visto la luz todo un conjunto de nuevas técnicas, en particular las conocidas como ómicas (para expresar el carácter global de la misma manera que el genoma se refiere a todos los genes de un organismo), que actualmente ya están disponibles.
Durante mucho tiempo los científicos se han tenido que limitar a la descripción del comportamiento de fermentación de las levaduras y a una comprensión a nivel macroscópico. Esto se ha logrado en diversos contextos por muchos grupos de investigación y ha permitido progresos considerables en el control de la fermentación alcohólica.
Sin embargo, el acceso a mecanismos más íntimos que subyacen en el comportamiento de los microorganismos ha sido difícil durante tiempo. Por ello los enólogos se han hecho siempre elementales preguntas tales como: ¿por qué esta levadura tiene más dificultades para acabar la fermentación que otra levadura determinada? ¿Por qué esa otra levadura da más aromas afrutados a baja temperatura? Estas preguntas sencillas no tienen respuesta la mayoría de veces. Es previsible que, en los próximos años, veamos notables avances especialmente en el conocimiento de los mecanismos genéticos, fisiológicos y bioquímicos que subyacen a estas propiedades. Por supuesto, cuando se dice conocimiento de los mecanismos, significa también entender los mecanismos de acción para intervenir y modular los efectos en la dirección deseada. Hay diversas maneras de mejorar las cepas, y se pueden considerar, según el caso, estrategias de genética clásica o de ingeniería genética para obtener una cepa con características nuevas.
El genoma: la información de base
En 1996 se dio un paso importante con la secuenciación del genoma completo por primera vez de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Goffeau et al. 1996). Ello reveló la disposición de unos 6000 genes en sus 16 cromosomas. Afortunadamente para la enología, este microorganismo preferido también había llegado a ser un organismo modelo, al ser el eucariota más sencillo, un organismo en el que es fácil adquirir los conocimientos básicos, y en torno al cual se habían movilizado muchos equipos de investigación. Se consiguió una producción considerable de datos que llevaron a la adjudicación de una función para un 80% de los 6000 genes identificados en este microorganismo. Si bien la obtención de la secuencia fue un paso importante, después ha sido necesario un largo trabajo, aún sin terminar, con el fin de asignar una función a cada uno de los genes.
Durante más de 10 años la comunidad de microbiólogos se ha basado en los datos de un único genoma de levadura, de una única cepa de laboratorio. Para los que trabajan con levaduras enológicas, era evidente que este genoma no se correspondía exactamente con el de sus cepas industriales preferidas. En efecto, diversas observaciones indicaban divergencias entre el genoma de la cepa de laboratorio y el de las enológicas. Recientemente la evolución de las capacidades de secuenciación ha permitido desvelar las diferencias genómicas entre las cepas enológicas y sus homólogas de laboratorio o las de otras industrias. Mientras que para obtener la secuencia de la primera cepa se habían necesitado casi 10 años de esfuerzos, con las nuevas tecnologías de secuenciación se puede obtener un genoma completo de levadura en un solo día (!). En la actualidad han sido descifrados genomas de más de 100 cepas diferentes (Liti et al., 2009). Ello ha permitido precisar las relaciones entre las cepas de diversos orígenes (vino, pan, etc.), analizando la distribución de unas 30 000 a 50 000 mutaciones que permiten distinguir entre dos clones. También se ha constatado que nuestras cepas enológicas forman un grupo que se diferencia claramente de las cepas de otros ambientes.
El resultado más sorprendente ha sido revelado por un análisis detallado del genoma completo de la cepa enológica EC1118, muy utilizada en vinificación (Novoet al. 2009). De hecho, este trabajo ha puesto en evidencia la existencia de genes nuevos, ausentes en las cepas de laboratorio, procedentes de otras especies diferentes de Saccharomyces cerevisiae, sobre todo de Zygosaccharomyces. Estos nuevos genes se habrían transmitido en sucesos improbables, de una especie a otra, por mecanismos mal conocidos de transferencia «horizontal». Así pues, en su historia las levaduras enológicas tienen uno o varios ancestros que han adquirido algunos genes debido a la compañía de cepas de otras especies en las cubas. Al mismo tiempo, estos resultados ponen de relieve la fragilidad de la barrera entre especies en términos de transferencia de genes. Antes pensábamos que esta barrera era muy sólida, pero no parece ser el caso.
Enfoques de genómica funcional
Si durante mucho tiempo las preguntas fueron del orden de «¿cuál es el gen responsable de esta función?», una vez que se conoce la secuencia del genoma, se plantean las preguntas inversas, como la recurrente: ¿para qué sirve este gen? , o mejor aún, ¿este gen tiene un papel importante en la fermentación alcohólica del vino? Se han desarrollado diversas estrategias y metodologías para responder a estas preguntas. La más sencilla consiste en inactivar un gen para evaluar el efecto de su ausencia en el comportamiento de la levadura. Esto es fácilmente realizable en S. cerevisiae. Para ello basta con construir un fragmento de DNA que contenga un gen de resistencia a una droga, flanqueado por dos partes similares al gen a estudiar. Mediante transformación y recombinación homóloga el fragmento en cuestión va a reemplazar el gen inicial en algunas células, que serán fácilmente seleccionadas porque son resistentes a la droga. De hecho, tras un gran esfuerzo colectivo, se construyó una colección de 6000 mutantes que contenían cada uno de los 6000 genes de la levadura inactivada. Los clones obtenidos han sido ampliamente utilizados para acceder a las funciones de los genes y evaluar su importancia en las condiciones enológicas. Sin embargo, estas colecciones tienen el inconveniente de haber sido desarrolladas con cepas de laboratorio, que no poseen todas las propiedades de las levaduras enológicas. Fermentan globalmente mal y no poseen los atributos aromáticos. Además, dependiendo de los objetivos y las condiciones de estudio, estas cepas no están siempre adaptadas a los análisis en la fermentación del vino. Por lo tanto, los microbiólogos que abordan estas cuestiones están obligados a menudo a realizar un trabajo equivalente de inactivación de genes en cepas enológicas (sobre todo, sus derivados haploides) para acceder a información fiable sobre el papel de los genes en el proceso de fermentación.
Enfoques de este tipo se han realizado en muchos genes. Muy a menudo los trabajos combinan diferentes enfoques y métodos asociados que permiten obtener una información sobre la expresión genética y la síntesis de la proteína correspondiente. Han sido particularmente útiles para aclarar el papel de los diferentes genes en el caso de familias multigénicas, donde varios genes similares son capaces a priori de realizar las mismas funciones. Estas situaciones son bastante frecuentes y se producen, por ejemplo, para los genes relacionados con la formación de ácido acético y que codifican para las aldehído deshidrogenasas (ALD) o para los genes de transporte de azúcares (HXT). En el caso de los genes ALD, se ha podido mostrar que, entre una familia de 6 genes, uno de ellos, ALD6, tenía un papel clave en la fermentación (Saint Prix et al., 2004). Este tipo de información es valiosa porque puede orientar los análisis y permite saber que las variaciones en la formación de acidez volátil están estrechamente relacionadas con el comportamiento del gen y las propiedades del enzima en cuestión. El transporte de azúcares, glucosa y fructosa, es también una situación ejemplar. La levadura contiene en su genoma más de 20 genes que codifican para los transportadores de hexosas HXT (hexose transporter). Esto es específico de S. cerevisiae y subraya la importancia de esta función para la levadura, que ha desarrollado un sistema complejo para optimizar la fermentación de azúcares presentes en las bayas. La cuestión que se planteó era conocer cuáles eran los transportadores que tenían un papel durante la fermentación alcohólica. El análisis del efecto de la inactivación de toda una serie de genes HXT permitió poner en evidencia que cinco de ellos intervenían en el ciclo fermentativo en fases diferentes, algunos al inicio, y otros para finalizar la utilización de azúcares, y que tenían un impacto variable. Un transportador clave, el más activo en la fermentación del vino, ha sido identificado de esta manera, como HXT3.
Los conocimientos adquiridos sobre los transportadores han resultado posteriormente ser muy útiles para entender las diferencias de comportamiento de las cepas comerciales con respecto a la utilización de azúcares. Se sabe que S. cerevisiae prefiere la glucosa a la fructosa, que por lo tanto es fermentada más tarde. Sin embargo, se habían observado diferencias entre cepas y hacía falta explicar por qué una cepa (Fermichamp) tenía una mejor capacidad de fermentar la fructosa. Dado que el transporte transmembrana es una etapa clave en el metabolismo de azúcares, se avanzó la hipótesis de una modificación del transporte en esta cepa. El análisis detallado de los genes de transporte permitió demostrar a continuación que esta cepa tenía un transportador HXT3 modificado más eficaz para la fructosa (Guillaume et al. 2007). Es evidente que la rápida resolución de esta cuestión no habría sido posible sin el trabajo previo de análisis funcional de los transportadores.
El análisis de la expresión de los genes
Un aspecto importante de la fisiología de los organismos está relacionado con el control de la expresión génica. Los genes no están todos activos, ni al mismo tiempo ni con la misma intensidad, y su actividad se ajusta en función de las necesidades de la célula. Podemos considerar la expresión de los genes a dos niveles: a nivel de RNA mensajero (o transcrito), o a nivel de proteínas. Las proteínas, la mayoría de las cuales son enzimas, son las entidades activas de la célula que determinan el estado del metabolismo mediante su acción (fig. 1). Sin embargo, se suele evaluar sobre todo la expresión de los genes midiendo los mRNA, porque las herramientas disponibles permiten medir su abundancia a nivel global (el transcriptoma, o sea, el conjunto de transcritos), que no es el caso de las proteínas (para el conjunto de proteínas se habla de proteoma). Desde hace 10 años se dispone de herramientas como los microarrays de DNA (chips de DNA o biochips), que permiten medir simultáneamente la expresión de los 6000 genes de la levadura, en base a la cantidad de mRNA de cada gen. La posibilidad de ver la totalidad del genoma de una levadura «en acción» durante una fermentación alcohólica ha sido un gran avance en la comprensión del comportamiento de la fermentación de la levadura.
Figura 1. De los genes a los metabolitos, con los diferentes niveles de análisis a considerar.

Los chips de DNA se basan todos en el mismo principio. En todos los casos, fragmentos de DNA correspondientes a cada gen son fijados en un soporte de vidrio, con densidades elevadas, de tal manera que se disponen los 6000 genes de la levadura en 3 cm2. La medida de la expresión de los genes se realiza por hibridación de una sonda sintetizada a partir de mRNA extraídos de las levaduras, y que se vuelve fluorescente (fig. 2).

Figura 2. Análisis de la expresión de genes por hibridación en microarrays o chips de DNA.

El análisis del transcriptoma primero fue utilizado para explorar la evolución del funcionamiento de los genes durante una fermentación alcohólica (Rossignol et al., 2003). Esto ha permitido ver cuáles son las prioridades de la levadura en fermentación. Por ejemplo, en base a la intensidad de la expresión génica, queda claro que transformar los azúcares en alcohol es una actividad clave de la levadura, pues el conjunto de genes de la vía glucolítica y fermentativa están fuertemente expresados durante todo el proceso. Por ejemplo, estos trabajos han permitido conocer que una de las prioridades de la levadura, una vez inoculada en el mosto, es su adaptación a la desaparición del oxígeno. Esto se traduce en particular en la inducción de genes que le permiten utilizar los esteroles presentes en el mosto, moléculas que la levadura ya no puede sintetizar en anaerobiosis. También ha sido posible precisar cómo la levadura se adapta durante la fermentación a un ambiente cada vez más estresante a causa del agotamiento de nutrientes y de la acumulación del etanol. Las levaduras reaccionan a estos cambios expresando los genes de estrés, cuyas proteínas les confieren una protección contra estas situaciones agresivas. Varios equipos de investigación han evaluado el efecto del nivel de nitrógeno de los mostos sobre la expresión génica, y han demostrado fuertes cambios de algunas vías metabólicas en función del nivel de nitrógeno (Mendes-Ferreira et al. 2007). Otros trabajos han permitido aclarar la respuesta de las levaduras a las bajas temperaturas de fermentación (Zuzuarregui et al. 2006).
La posibilidad de tener una visión global del funcionamento del genoma ha sido un gran aporte para la comprensión del metabolismo de la levadura que está fermentando. No es menos cierto que las medidas de expresión se limitan sobre todo a la cuantificación de los mRNA. Esto supone un límite importante de estos estudios, pues se sabe que los niveles de proteínas no están siempre perfectamente correlacionados con el RNA correspondiente. Los enfoques «semiglobales» de la medida de las proteínas son posibles mediante la técnica de electroforesis bidimensional. Mediante estos planteamientos, se pueden cuantificar normalmente unas 1000 proteínas. Así pues, sólo es accesible una fracción del proteoma. Muy recientemente han surgido otras técnicas más potentes, pero que por el momento son difícilmente accesibles.
El reto más importante sigue siendo tratar de recopilar la información lo más global posible a los diferentes niveles de funcionamiento de la célula: transcriptoma, proteoma, pero también el metaboloma, o conjunto de metabolitos de la célula. Se trata de ser capaz de integrar los diferentes niveles de análisis para poder representar el funcionamiento del sistema con la ayuda de modelos matemáticos. Entonces se habla de biología de sistemas, que es una disciplina que ha surgido los últimos años y que tiene un futuro prometedor.
La genética para entender las bases de la biodiversidad
Tal como se ha mencionado antes, la comprensión de las bases genéticas de las diferencias en las propiedades de las cepas es un objetivo importante para la mejora de las levaduras. La determinación del origen genético de las propiedades de interés (velocidad de fermentación, producción de compuestos aromáticos, etc.) ha sido muy difícil durante mucho tiempo, sobre todo porque se trata de propiedades complejas, o sea que dependen de la actividad de varios, o incluso de muchos, genes. Aunque las técnicas genéticas que permiten estudiar estas propiedades son utilizadas desde hace tiempo en animales o en plantas (por ejemplo para identificar genes determinantes de la talla de la espiga de trigo o del peso del animal), estas técnicas para levadura se han desarrollado sólo recientemente. Este enfoque, denominado genética cuantitativa, se ha visto también facilitado por la llegada de nuevas herramientas de análisis, como los chips de DNA.
Las estrategias puestas a punto se basan en la identificación de regiones del genoma o QTL (Quantitative Trait Locus, locus de características cuantitativas) que afectan a la característica analizada. Para ello se crea una población recombinante mediante el cruzamiento de dos cepas que tienen valores muy diferentes para un carácter determinado (una de valor alto con otra de valor bajo). Después de la esporulación, se obtiene la población de clones que contienen los genomas de ambos padres totalmente reorganizados (de hecho recombinantes). Entonces, usando herramientas moleculares (marcadores), se procede a identificar el origen parental de cada región del genoma de los clones (fig. 3). Los valores de la característica se miden en todos los individuos y se evalúa la existencia de una relación estadística entre el origen parental de una región del genoma y el valor de la característica. Aunque bastante sencillos en principio, estos procedimientos son realmente complejos y pueden ser difíciles de aplicar según la situación genética analizada. Se han utilizado con éxito para identificar las bases genéticas de diferentes características enológicas (Marullo et al. 2007). Nuestro equipo se ha centrado en las diferencias de rendimiento en fermentación entre una cepa enológica y otra de laboratorio. De esta manera se ha identificado un gen que explica la diferencia de velocidad máxima de fermentación entre la cepa comercial EC1118 y la cepa de laboratorio S288C. Así, hemos podido demostrar que la cepa enológica tiene un alelo más eficaz para un gen de síntesis del p-aminobenzoico, que influye en la velocidad de fermentación mediante el control de la utilización del nitrógeno.
Figura 3. La búsqueda de QTL. El análisis del genotipo tiene como objetivo identificar marcadores que permitan identificar el origen parental de la región cromosómica. Diferentes métodos que permiten detectar mutaciones pueden ser utilizados, en particular los chips de DNA.

Conclusión
Evidentemente el acceso a los conocimientos sobre el genoma y su funcionamiento ha entrado en una nueva era con la llegada de un arsenal de herramientas y procedimientos cada vez más potentes. El aspecto más notable es la puesta a punto de técnicas de « alto rendimiento », que abarcan desde el análisis de los genomas hasta el estudio de su funcionamiento. El día de mañana, conocer la secuencia de una levadura de vino será una información básica a la que cualquier investigador va a tener fácil acceso. La combinación de estas herramientas y procedimientos actualmente permite a los expertos en genómica y en genética abordar eficazmente viejas preguntas que no tenían respuesta, sobre el comportamiento de la levadura del vino en fermentación. De esta manera se debería ir hacia una mejor comprensión de las bases moleculares de la biodiversidad de las levaduras. Este conocimiento en detalle debe beneficiar en gran medida los procedimientos de selección y de mejora genética de las cepas. En particular, será posible implementar estrategias de hibridación de las cepas con el fin de introducir en las levaduras enológicas las características específicas para una mejor adaptación a las condiciones de vinificación y a la demanda de los enólogos.

Bibliografía
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