28/5/15

Levaduras alternativas a Saccharomyces cerevisiae.


Pilar Morales y Ramón González Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino
(CSIC-Universidad de La Rioja-Gobierno de La Rioja), Logroño
www.icvv.es/microwine
El interés por las levaduras distintas deSaccharomyces cerevisiae en el ámbito enológico (conocidas habitualmente con el poco riguroso nombre de «noSaccharomyces») ha experimentado un auge extraordinario durante los últimos cinco o seis años, si bien el interés por la ecología microbiana del vino, y los intentos de aprovechar ese conocimiento para introducir mejoras en los procesos fermentativos datan de varias décadas atrás (Carrascosa, 2011). Ya en los años cincuenta y sesenta del siglo pasado hubo investigadores italianos y españoles (en este caso del extinto Instituto de Fermentaciones Industriales del CSIC) que trataron de explotar el potencial de estas levaduras, denominadas en aquellos trabajos como «levaduras de primera o de segunda fase de la fermentación», según los casos (Castelli, 1954; Castelli e Iñigo, 1957; Iñigo, 1986). Sin embargo, por motivos diversos, estos trabajos acabaron cayendo casi completamente en el olvido.
El interés que despiertan actualmente estas levaduras es fruto de una evolución temporal durante la que se han ido produciendo avances en nuestro conocimiento sobre la microbiología enológica, y se han desarrollado nuevas herramientas de biotecnología microbiana.
En su forma más tradicional, la fase principal de la vinificación consiste en la fermentación espontánea del mosto de uva. Se trata de un proceso microbiológicamente complejo, en el que intervienen decenas de cepas de levaduras, pertenecientes a varios géneros y especies. Si bien estos procesos espontáneos pueden dar lugar a vinos de una calidad excepcional y con una gran complejidad de matices sensoriales, se trata de procesos con un grado de incertidumbre elevado, una incidencia relativamente alta de desarrollo de especies microbianas alterantes (levaduras y bacterias), arranques difíciles, fermentaciones lentas, e incluso paradas de fermentación por diferentes motivos.
El desarrollo de los cultivos iniciadores de Saccharomyces cerevisiae, la especie predominante en prácticamente todos los procesos de vinificación, en las etapas intermedias y finales de la fermentación, supuso un cambio muy importante respecto a la situación anterior. Muchas bodegas comenzaron a utilizar estas levaduras para garantizar tanto un proceso de fermentación exitoso como cierta reproducibilidad en las características del vino de diferentes añadas. Cuando se realiza una buena elección de la cepa del cultivo iniciador, la inoculación de levadura seca activa conduce a arranques de fermentación rápidos, una buena cinética de fermentación y, desde el punto de vista microbiológico, un predominio de la cepa inoculada casi desde el inicio del proceso, con la consiguiente simplificación de la ecología microbiana de la fermentación.
En la implantación de esta práctica, genuinamente biotecnológica, desempeñaron un papel muy importante las industrias productoras de levaduras, que en relativamente poco tiempo desarrollaron los procesos de producción de levadura seca activa. En contraste con la levadura fresca, que tiene un período de uso muy corto, las levaduras secas activas pueden ser almacenadas durante períodos prolongados, simplificando su uso para los enólogos, y permitiendo a la vez a las industrias productoras evitar los costes excesivos asociados a la estacionalidad de la producción de levaduras frescas ad hoc para cada vendimia.
Sin embargo, si bien S. cerevisiae es la principal especie de levadura responsable de la transformación del mosto de uva en vino, no es generalmente la predominante en uvas sanas en el momento de la vendimia. La consideración de S. cerevisiaecomo la levadura óptima para llevar a cabo el proceso de fermentación, consagrada por el desarrollo de los cultivos iniciadores industriales, rebajó en su momento a la condición de «alterantes» al resto de especies de levaduras presentes en los mostos (al menos en la opinión de muchos). Por lo tanto, inicialmente, la reducción de la diversidad de microorganismos era contemplada como una ventaja o parte del mecanismo de garantía de la calidad que justificaba el uso de levaduras secas.
Con el tiempo, gracias a algunos trabajos preliminares (véase ejemplos antes) y la contribución de numerosos microbiólogos, se fueron acumulando evidencias en contra de esa visión simplificada de las levaduras alternativas a S. cerevisiae. Si bien existen ejemplos claros de especies indeseables en cualquier fase de la vinificación (Brettanomyces), los ejemplos de contribuciones potencialmente positivas para la calidad del vino del metabolismo de otras especies o cepas de levaduras presentes habitualmente en fermentaciones espontáneas iban siendo cada vez más numerosos. A esto se añadía una corriente «purista» que interpretaba que la utilización de levaduras secas activas introducía un factor de uniformización en los vinos de diferentes variedades, regiones y añadas, que iba en detrimento de la diferenciación y «autenticidad», así como fundamentalmente de la complejidad aromática, como factores de calidad de los vinos.
La incorporación de cultivos iniciadores de estas especies alternativas se planteaba así como una estrategia prometedora para aunar las ventajas de una fermentación controlada desde el punto de vista microbiológico, con una diversidad de levaduras que permita recuperar los rasgos más interesantes de una fermentación espontánea.
.«En este dossier se incorporan diversos puntos de vista sobre esta nueva o recuperada tendencia en biotecnología enológica, a cargo de grupos de investigación que están trabajando sobre la biodiversidad microbiana enológica y el desarrollo de cultivos iniciadores.»
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En este dossier se incorporan diversos puntos de vista sobre esta nueva o recuperada tendencia en biotecnología enológica, a cargo de grupos de investigación que están trabajando sobre la biodiversidad microbiana enológica y el desarrollo de cultivos iniciadores. Aunque su contribución a la complejidad aromática fue el principal aspecto que históricamente atrajo la atención de los investigadores y enólogos por estas levaduras, este dossier muestra que hay varios aspectos adicionales de la diversidad metabólica de las levaduras que se podrían tener en cuenta en el desarrollo de nuevos cultivos iniciadores, incluyendo múltiples actividades enzimáticas, liberación de compuestos derivados de la pared celular, o reducción del grado alcohólico. También hay un espacio para las últimas técnicas aplicadas a estudios de biodiversidad, selección de levaduras y optimización de condiciones de uso de estas nuevas levaduras.
En el futuro habrá que tener en cuenta aspectos adicionales que van a ser muy relevantes en el desarrollo de cultivos iniciadores basados en levaduras alternativas a S. cerevisiae, como la optimización de los procesos industriales de producción de biomasa y secado, o el estudio de las interacciones entre diversas cepas de levaduras. También habrá que mantener la vista puesta en el trabajo de otros investigadores españoles, que tratan de explotar la diversidad genética dentro del género Saccharomyces (hay quien se refiere a ellas como no cerevisiae) ya que existen diferencias metabólicas muy importantes entre diversas especies del mismo.
En resumen, la biotecnología enológica es un campo muy activo actualmente, que puede dar lugar a interesantes avances técnicos. Uno de los ámbitos más dinámicos en los últimos años es el de los cultivos iniciadores alternativos a S. cerevisiae. Nuestro país cuenta con una amplia comunidad de investigadores reconocidos en este campo, y por lo tanto hay grandes oportunidades para que las empresas españolas puedan beneficiarse de la transferencia potencial de los conocimientos generados en este campo.

Agradecimientos
Queremos agradecer a Alfonso V. Carrascosa haber compartido con nosotros sus conocimientos sobre la historia de la microbiología enológica española.

Bibliografía
Carrascosa A. V.: Orígenes de la microbiología enológica y la ecología microbiana de los alimentos española y del Bierzo. Estudios Bercianos 2011; 36: 163-76.
Castelli T.: Les agents de la fermentation vinaire. Archiv Mikrobiol 1954; 20: S323-42.
Castelli T., Iñigo B.: Los agentes de la fermentación vínica en la región manchega y zonas limítrofes. Ann Fac Agr Perugia 1957; XIII: 17 pp.
Iñigo B.: 1986. Elaboración ecológica del vino. Enología y Enotecnia 1986; 1: 10-3.

21/5/15

Mejorar la extracción fenólica en la elaboración del vino tinto

Eduardo Puértolas, Ignacio Álvarez y Javier Raso
Tecnología de los Alimentos
Facultad de Veterinaria
Universidad de Zaragoza
edupg@unizar.es
Los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) son una tecnología emergente de procesado que ha despertado un gran interés en los últimos años para mejorar la transferencia de masa a través de membranas celulares (Vorobiev y Lebovka, 2006). El proceso se basa en aplicar intermitentemente a un material colocado entre dos electrodos campos eléctricos de alta intensidad (hasta 10 kV/cm) y corta duración (microsegundos). Estos tratamientos provocan la electroporación de las membranas de las células eucariotas, aumentando su permeabilidad y facilitando, en consecuencia, la difusión de solutos hacia exterior celular. Los principales parámetros que determinan la eficacia del proceso son la intensidad del campo eléctrico (kV/cm) y el número de pulsos aplicado que a su vez está relacionado con el tiempo de tratamiento. Debido a los particulares efectos de los PEAV sobre las membranas celulares, esta tecnología podría tener interés en muchos procesos de la industria alimentaria que tienen como objetivo la extracción de componentes intracelulares.
En el proceso tradicional de elaboración de vino tinto, la fermentación de los azúcares del mosto se realiza en presencia de los hollejos de la uva. En esta etapa, por una parte los azúcares se transforman en alcohol por acción de las levaduras, y por otra se produce la extracción de diversas sustancias presentes en los hollejos, entre las que se encuentran los compuestos fenólicos. Estos compuestos se localizan principalmente en la piel de la uva y juegan un papel fundamental en las características sensoriales del vino tinto, siendo los máximos responsables de su color (Boulton, 2001). Además, los efectos beneficiosos para la salud humana que se atribuyen al consumo de vino tinto se relacionan con la presencia de sustancias fenólicas (Estruch, 2000).
El mercado enológico actual demanda vinos tintos de color intenso y con alta concentración fenólica. Para su obtención, se promueven maceraciones de larga duración que dificultan la rotación de los depósitos de fermentación en las bodegas y que producen un peor aprovechamiento de su volumen útil, ya que un porcentaje del mismo está ocupado por los hollejos. Además, la presencia de los hollejos dificulta un control adecuado de la temperatura de fermentación, lo que puede provocar que el proceso se detenga. Por todo ello, la búsqueda de técnicas que faciliten la extracción de los compuestos fenólicos está recibiendo un especial interés en las bodegas (Sacchi et al., 2005). Para conseguir este objetivo se han propuesto diferentes técnicas como el aumento de la temperatura de fermentación, la termovinificación, la criomaceración, la vinificación en doble pasta, el sangrado o el uso de enzimas pectolíticos. Aunque estas técnicas se han mostrado efectivas, ninguna de ellas se ha generalizado en las bodegas.
El objetivo de esta revisión es evaluar la posible aplicación de los PEAV en la industria enológica para mejorar la extracción fenólica en el proceso de elaboración de vino tinto, en función de los resultados y avances técnicos más importantes obtenidos hasta la fecha.
Efecto de los PEAV en el color y el contenido fenólico del vino tinto durante la fase de maceración/fermentación
Los primeros estudios obtenidos demostraron que la aplicación de un tratamiento de PEAV a la uva, previamente al proceso de maceración-fermentación, permite obtener vinos recién fermentados de las variedades tempranillo, cabernet sauvignon, mazuelo y graciano con una mayor intensidad de color (IC), contenido antociánico (CA) e índice de polifenoles totales (IPT) (López et al., 2008a; 2008b; 2008c; 2009). En todos los casos se aplicaron 50 pulsos, variando la intensidad del campo eléctrico de 2 a 10 kV/cm y, por lo tanto, la energía específica de los tratamientos de 0,4 a 6,7 kJ/kg. Se observó que el efecto de los PEAV depende en gran medida de la variedad y del grado de madurez de la uva, obteniéndose mejoras de entre un 19 y un 61% en la IC, de entre un 18 y un 43% en el CA, y de entre un 14 y un 45% en el IPT. Fruto de estas investigaciones, se constató el importante potencial de la tecnología de los PEAV para obtener vinos con elevado contenido fenólico o para acortar el tiempo de maceración necesario para obtener un nivel fenólico determinado. Sin embargo, el equipo utilizado para realizar estos primeros estudios distaba de los requerimientos necesarios para la aplicación del proceso en las bodegas, ya que la cámara de tratamiento utilizada solamente permitía procesar 20 g de uva. Por ello, los primeros resultados se obtuvieron realizando microvinificaciones que no permitían obtener una cantidad de vino suficiente para realizar análisis sensoriales o estudios de envejecimiento.
Con el fin de estudiar la viabilidad técnica de la aplicación de los PEAV para la mejora de la extracción de compuestos fenólicos en el proceso de elaboración de vino tinto, se desarrollo un sistema en continuo a escala planta piloto que permite la aplicación de tratamientos de PEAV de una intensidad del campo eléctrico de hasta 7 kV/cm, a una velocidad de flujo de hasta 118 kg/h (Puértolas et al., 2010a). Para establecer las condiciones de tratamiento, se decidió estudiar la cinética de extracción de sustancias antociánicas y de fenoles totales, realizando vinificaciones de 10 kg de tres variedades de uva, cabernet sauvignon, merlot y syrah (Puértolas et al., 2010a). A modo de ejemplo, en la figura 1 se muestra la evolución del CA y el IPT durante la fermentación en la variedad cabernet sauvignon. Todos los tratamientos de PEAV estudiados (2, 5 y 7 kV/cm; 50 pulsos) permitieron mejorar la extracción de antocianos y de fenoles totales. El tratamiento óptimo, 50 pulsos de 5 kV/cm, permitió obtener una mejora en el CA y el IPT de un 34 y un 40%, respectivamente.


Figura 1. Evolución durante la fermentación alcohólica del contenido antociánico (mg/L) (CA) y el índice de polifenoles totales (IPT), tanto del vino control (■) como de los vinos obtenidos a partir de uva tratada por PEAV: 2 kV/cm; 50 pulsos (), 5 kV/cm; 50 pulsos () y 7 kV/cm; 50 pulsos ()


Efecto de los PEAV en la evolución cromática y fenólica del vino tinto
Una vez demostrada la posibilidad de tratar la uva en flujo continuo, el siguiente paso fue comprobar si las mejoras obtenidas tras la fermentación se mantenían durante el resto del proceso de elaboración del vino hasta su consumo (Puértolas et al., 2010b; 2010c; 2010d). Para ello, se realizaron vinificaciones de 100 kg de uva de la variedad cabernet sauvignon, aplicando el tratamiento óptimo determinado en el estudio anterior, 50 pulsos de 5 kV/cm.
En estas investigaciones, la duración de la maceración se estableció en función de la evolución de la concentración fenólica a lo largo de la fermentación, retirándose los hollejos del mosto cuando se obtuvo un IPT similar durante dos días consecutivos. Así, mientras que en los vinos control la duración de la maceración fue de 144 horas, la de los vinos tratados por PEAV fue de 96 horas. Por lo tanto, ésta se acortó en 48 horas. Además, los vinos obtenidos mediante PEAV mostraron, al final de la fermentación, mayor contenido fenólico que los controles (Puértolas et al.,2010b). Estos resultados confirmaron los obtenidos por Lopez et al. (2009) a escala de laboratorio.
En este mismo estudio, tras 4 meses de almacenamiento se realizó un análisis físico-químico general, no observándose diferencias en el grado alcohólico, pH, acidez total, acidez volátil y concentración de azúcares reductores entre el vino control y el obtenido a partir de uvas procesadas por PEAV. Este último presentó una IC, un TPI, un CA y una concentración de taninos un 27, un 18, un 10 y un 23% mayor que el vino control. Por su parte, el análisis HPLC de las sustancias fenólicas desveló que los perfiles fenólicos de ambos vinos fueron similares, por lo que se puede deducir que los tratamientos de PEAV no afectan de manera específica a una determinada familia de sustancias fenólicas, aumentando la concentración de todas ellas de una manera similar. López et al. (2009) obtuvieron resultados similares en el estudio del perfil antociánico de los vinos de cabernet sauvignon tratados mediante PEAV a escala de laboratorio.
Posteriormente, debido a la importancia del proceso de envejecimiento en la calidad del vino tinto, se decidió estudiar la evolución del color y de los principales compuestos fenólicos, antocianos monómeros, flavan-3-oles, ácidos hidroxicinámicos y flavonoles, durante 12 meses de almacenamiento en botella (figura 2) (Puértolas et al., 2010c). Las diferencias en la IC observadas en el momento del embotellado entre el vino control y el elaborado a partir de uvas procesadas por PEAV permanecieron constantes durante 12 meses de embotellado.



Figura 2. Evolución de la intensidad de color (IC) y de la concentración de antocianos monómeros, flavan-3- oles, ácidos hidroxicinámicos y flavonoles, tanto del vino control (barras negras) como del obtenido mediante PEAV (5 kV/cm; 50 pulsos) (barras rojas) a lo largo de 12 meses de almacenamiento en botella. Tiempo de maceración: 144 horas para el control y 96 horas para el vino obtenido mediante PEAV

Todas las sustancias fenólicas investigadas siguieron un patrón de evolución similar. La concentración total de antocianos, flavan-3-oles, ácidos hidroxicinámicos y flavonoles disminuyó a lo largo del almacenamiento. Tras los 12 meses en botella, mientras que la concentración de antocianos monómeros fue similar en ambos vinos, la concentración de flavan-3-oles, flavonoles y ácidos hidroxicinámicos fue mayor en los vinos obtenidos con uva procesada por PEAV. Similares resultados se obtuvieron cuando se estudió la evolución de las características cromáticas y fenólicas ambos vinos tras 6 meses de envejecimiento en barrica y 8 meses de posterior almacenamiento en botella (Puértolas et al., 2010d). De acuerdo a estos estudios, la tecnología de los PEAV es una prometedora técnica enológica para conseguir el alto contenido fenólico necesario en la producción de vinos envejecidos.
Efecto de los PEAV en las características sensoriales del vino tinto
Con objeto de determinar si la aplicación de los PEAV producía la formación de aromas o sabores extraños, los vinos tintos cabernet sauvignon fueron evaluados sensorialmente tras 4 meses de almacenamiento en botella (Puértolas et al., 2010b). Los descriptores utilizados fueron intensidad de color, astringencia, bouquet, flavor y evaluación global. A pesar de que lo catadores determinaron la existencia de diferencias en algunos descriptores como la astringencia, posiblemente debido a la alta concertación fenólica de los vinos obtenidos mediante PEAV, estas nunca fueron estadísticamente significativas. Los vinos envejecidos en barrica de roble también fueron sometidos a análisis sensorial tras 8 meses de almacenamiento en botella, no detectándose diferencias entre ellos (Puértolas et al., 2010d). Por lo tanto, a la vista de estos resultados, se puede concluir que el tratamiento de PEAV no produce la formación de aromas o sabores extraños ni afecta negativamente a la calidad sensorial del vino tinto.
Viabilidad de la aplicación de los PEAV en bodega
La aplicación de los PEAV para mejorar la extracción de compuesto fenólicos requiere poder disponer de equipos con una capacidad de producción que cumpla con los requerimientos de producción de una bodega. Progresivamente se van desarrollando equipos cada vez más potentes y por lo tanto más próximos a las necesidades industriales.
En la actualidad, nuestro grupo de investigación dispone de un sistema de PEAV que permite la aplicación de tratamientos a un flujo de hasta1600 kg/h (Puértolaset al., 2010e) (figura 3). Según nuestros resultados, el requerimiento energético necesario para la permeabización de las membranas celulares de los hollejos de la uva es inferior a 10 kJ/kg. En base a un precio del kWh de 10 céntimos de euro, se traduce en un coste aproximado de 0,1 €/ton.


Figura 3. Sistema de PEAV desarrollado en la Universidad de Zaragoza para la aplicación de tratamientos a la uva a un flujo de 1600 kg/h

Conclusiones
A partir de los resultados presentados en esta revisión, los PEAV es una tecnología técnicamente viable para mejorar la extracción fenólica en el proceso de elaboración de vino tinto. Establecer la viabilidad económica de su aplicación requiere un estudio más profundo en el que se consideren por un lado los costes (amortización del equipo, coste de los tratamientos, etc.) y, por otro, los beneficios económicos derivados de su empleo (incremento del valor añadido, reducción del tiempo de maceración, etc.). En cualquier caso, con objeto de evaluar la aplicación real de la tecnología en la industria enológica es necesario realizar vinificaciones en las propias bodegas para verificar los buenos resultados obtenidos en planta piloto.

Bibliografía
Boulton RB, 2001. The copigmentation of anthocyanins and its role in the colour of red wine: A critical review.American Journal of Enology and Viticulture 55, 67-87.
Estruch R, 2000. Wine and cardiovascular disease. Food Research International 33, 219-226.
López N, Puértolas E, Condón S, Álvarez I, Raso J, 2008a. Effects of pulsed electric fields on the extraction of phenolic compounds during the fermentation of must of Tempranillo grapes. Innovative Food Science and Emerging Technologies 9, 477-482.
López N, Puértolas E, Condón S, Álvarez I, Raso J, 2008b. Application of pulsed electric fields for improving the maceration process during vinification of red wine: influence of grape variety. European Food Research and Technology 227, 1099-1107.
López N, 2008c. Mejora de la transferencia de masa mediante Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje: aplicación a la extracción de sacarosa, betaninas y al proceso de elaboración de vino. Tesis Doctoral. Universidad de Zaragoza, España.
López N, Puértolas E, Hernández-Orte P, Álvarez I, Raso J, 2009c. Effect of a pulsed electric field treatment on the anthocyanins composition and other quality parameters of Cabernet Sauvignon freshly fermented model wines obtained after different maceration times. LWT-Food Science and Technology 42, 1225-1231.
Puértolas E, López N, Saldaña G, Álvarez I, Raso J, 2010a. Evaluation of phenolic extraction during fermentation of red grapes treated by a continuous pulsed electric fields process at pilot-plant scale. Journal of Food Engineering 98, 120-125.
Puértolas E, Hernández-Orte P, Saldaña G, Álvarez I, Raso J, 2010b. Improvement of winemaking process using pulsed electric fields at pilot-plant scale. Evolution of chromatic parameters and phenolic content of Cabernet Sauvignon red wines. Food Research International 43, 761-766.
Puértolas E, Saldaña G, Condón S, Álvarez I, Raso J, 2010c. Evolution of polyphenolic compounds in red wine from Cabernet Sauvignon grapes processed by pulsed electric fields during aging in bottle. Food Chemistry119, 1063-1070.
Puértolas E, Saldaña G, Álvarez I, Raso J, 2010d. Effect of pulsed electric fields processing of red grapes on wine chromatic and phenolic characteristics during aging in oak barrels. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 2351-2357.
Puértolas E, López N, Condoón S, Álvarez I, Raso J. 2010e. Potential applications of PEF to improve the red wine quality. Trends in Food Science and Technology 21, 247-255.
Sacchi KL, Bisson LF, Adams D, 2005. A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines. American Journal of Enology and Viticulture 56, 197-206.
Vorobiev E, Lebovka NI, 2006. Extraction of Intracellular Components by Pulsed Electric Fields. En J Raso, V Heinz (Eds.), Pulsed Electric Fields Technology for the Food Industry. Fundamentals and Applications. Nueva York: Springer. pp. 153-193.

18/5/15

Optimización de la crianza sobre lías


Felipe Palomero, José Antonio Suárez-Lepe, Antonio Morata, Santiago Benito
y Fernando Calderón
Grupo de Investigación Enología, Enotecnia y Biotecnología Enológica
ETSI Agrónomos. Universidad Politécnica de Madrid
Este artículo es la primera parte del proyecto ganador del II Premio Cristòfor Mestre i Artigas, fallado en 2011 por el Consejo Regulador del Cava, el Incavi y el Museo de las Culturas del Vino de Cataluña. El estudio identifica las características para determinar los aromas del vino y sus conclusiones permiten reducir el tiempo de crianza, mejorar la eficiencia en la elaboración y hacer desaparecer gustos no deseables en el proceso de envejecimiento.
Preámbulo general del proyecto
Las lías vínicas de fermentación son el residuo formado al decantar la biomasa de levaduras responsables de la fermentación alcohólica de un mosto. Esta población microbiológica será, en mayor o menor medida heterogénea, en función de la inoculación o no de una cepa de levadura seleccionada, y de su implantación. Poblaciones de bacterias lácticas y/o acéticas así como diferentes sales tartáricas y restos vegetales derivados del procesado de la vendimia, pueden encontrarse también acumulados en el fondo de un depósito tras la fermentación.
En la práctica existen múltiples formas que permiten su realización, y que quizás deriven del alto grado de empirismo que subyace a la técnica. Principalmente los protocolos se distinguen en función de la proporción de biomasa celular utilizada, el continente empleado (barricas o depósitos), y/o la frecuencia de resuspensiones de las lías durante el período de crianza. Todos estos parámetros no están sujetos a reglas precisas por lo que en la práctica industrial, la ejecución de la técnica puede variar considerablemente entre diferentes bodegas. Existe una correlación entre la evolución fisicoquímica y sensorial de un vino en contacto con sus lías de levadura, y el grado de autolisis de las mismas. Etimológicamente, el término autolisis es muy gráfico para describir la autodestrucción hidrolítica de la célula. Una importante dotación enzimática intracelular es liberada en respuesta a determinadas señales bioquímicas que preceden a la muerte celular. El inicio temporal de este proceso coincide con el ocaso de la fase tumultuosa, cuando el contenido nutritivo es ya escaso, y las células pierden progresivamente su capacidad para multiplicarse.
Durante el proceso se liberan de forma gradual al medio una importante cantidad de moléculas y biopolímeros, citosólicos y/o parietales, que modifican las características organolépticas de los vinos (equilibrio coloidal, estructura, estabilidad de color, perfil aromático, etc.). Las moléculas liberadas a partir de la ruptura autolítica se pueden clasificar según el siguiente esquema (figura 1):
Figura 1. Compuestos liberados en el transcurso de la crianza sobre lías, y respectivos papeles enológicos (Fuente: Adaptada de Feuillat, 1998).


En el enriquecimiento y mejora de las cualidades gustativas de los vinos reside el gran atractivo e interés de la técnica, más aún considerando la actual estandarización del mercado, y la importante necesidad de las bodegas por diferenciarse en sus productos para ser competitivas. Debido a la gran cantidad de recursos que son necesarios para su realización resulta una técnica cara y no exenta de dificultades. Pero además de los inconvenientes de índole material intrínsecos, el enólogo debe ser consciente de que la adición al vino de lías supone un enriquecimiento en nutrientes, que pueden provocar crecimientos microbianos no deseados y desviaciones sensoriales derivadas. Por tanto, se requiere un especial cuidado en el seguimiento periódico de parámetros analíticos y sensoriales, ya que la técnica implica asumir cierta inestabilidad microbiológica.
En este ámbito, y con el propósito de reducir estos inconvenientes, la industria enológica ha desarrollado preparados enzimáticos comerciales con el fin de optimizar y acelerar la autolisis en vinos en crianza sobre lías. Estos productos son, generalmente, mezclas de varias actividades enzimáticas y permiten incrementar de forma muy notable y rápida las concentraciones de polisacáridos. Actualmente existe una gran diversificación en lo referente a estos productos, sin embargo pueden presentar una serie de inconvenientes. Entre los mismos, varios autores han descrito su falta de especificidad en condiciones de vinificación y/o la posible presencia de actividades contaminantes colaterales.
No en vano, la efectividad enzimática de este tipo de preparaciones, así como la naturaleza de su actividad dependen en gran parte de parámetros como la cepa fúngica utilizada o las condiciones de crecimiento empleadas en su producción. Resultarán cruciales a este respecto los protocolos de cada empresa para aislar y purificar cada actividad enzimática.
Además, la adición de enzimas aunque realizada de forma racional y juiciosa, no está exenta de cierta controversia debido en parte a la tendencia cada vez más extendida por parte del consumidor, de reclamar productos con la mínima cantidad de aditivos así como ser considerada por algunos puristas, como una prácticaartificial y poco natural del enólogo.
La optimización de la biotecnología fermentativa mediante selección clonal clásica de levaduras, se realiza en base a criterios generales o clásicos, y específicos cada vez más ajustados al vino que se pretende elaborar. De hecho, estos criterios de interés enológico están en constante evolución y se actualizan a medida que se profundiza en el conocimiento de la fisiología/morfología de las levaduras. En muchas ocasiones los nuevos criterios de interés enológico para la selección de cepas, surgen de problemáticas enológicas concretas, como en el ámbito que nos ocupa las anteriormente comentadas.
Sin embargo, el protocolo industrial tradicional de la crianza sobre lías no permite la disociación desde el punto de vista microbiológico, entre la fase de fermentación alcohólica y la posterior etapa de crianza. Las exigencias de la etapa fermentativa requieren la participación «activa» de cepas con perfiles metabólicos óptimos según criterios específicos de vinificación. Pero estos criterios u objetivos difieren sensiblemente de los que serían propios y deseados en etapas posfermentativas cuando se apuesta por la participación «pasiva» de una determinada población de levaduras en contacto con el vino.
En este último caso, la generación exógena de una biomasa exenta de nutrientes y contaminantes a partir de una cultivo puro de levadura ya seleccionado –y su posterior adición al vino–, permitiría la aplicación de un proceso de selección según criterios puramente relacionados con la liberación autolítica de compuestos celulares. Se podría así optimizar la crianza sobre lías en cuanto a tiempos de crianza y características sensoriales asociadas, minimizando al tiempo los posibles riesgos microbiológicos.
Se pretenden valorar diferentes géneros de levadura Saccharomyces y noSaccharomyces, que a pesar de no ser fermentativamente adecuados, podrían mostrar comportamientos óptimos en crianza sobre lías debido a sus especiales carácterísticas ecofisiológicas. Existe una posibilidad real de aplicación de algunos géneros no Saccharomyces, explotando el importante capital natural de la biodiversidad y variabilidad genética que éstos representan.
I. Primer trabajo experimental: 
Crianza sobre lías en vinos tintos. Efecto sobre la liberación de polisacáridos y el contenido de antocianos monómeros
I.1. Introducción
Históricamente la crianza sobre lías se ha empleado en la elaboración de vinos blancos fermentados en barrica (Borgoña), vinos espumosos naturales (Champagne, Cava), y vinos de crianza biológica con levaduras de flor (Jerez). En la actualidad la crianza sobre lías de vinos tintos está siendo utilizada por muchas bodegas ya que permite la obtención de vinos de calidad permitiendo mejorar su estructura, perfil aromático y estabilidad de color.
La crianza sobre lías comienza con la autolisis de las levaduras que supone la hidrólisis de las envueltas celulares y la posterior cesión de sus moléculas y biopolímeros al medio (Babayan at al., 1981; Babayan & Bezrukov, 1985). La pared celular de S. cerevisiae está constituidas por manoproteínas entramadas por fibras de glucano y quitina (Pretorius, 2000). Durante la autolisis existe una desestructuración de la pared celular por rotura de las fibras de glucanos y quitina debido a la propia dotación enzimática de la levadura. También existe hidrólisis de proteínas que incrementa los contenidos nitrogenados del vino (Lurton at al., 1989; Sato at al., 1997); como consecuencia de esta despolimerización y proteólisis las envueltas celulares pierden rigidez (Feuillat, 1998). Las glucanasas, presentes en la pared hasta después incluso de 4 meses, y las manosidasas en menor parte, son las responsables de la degradación de las envueltas celulares (Charpentier y Fressinet, 1989). El aumento de la fracción lipídica, origina un enriquecimiento de la fracción aromática del vino, debido a reacciones secundarias de formación de ésteres y aldehídos (Pueyo at al., 2000).
Los polisacáridos liberados son agentes estabilizadores contra precipitaciones tartáricas (Lubbers at al., 1994), y proteicas (Moine-Ledoux at al., 1997). También interaccionan con la fracción fenólica, permitiendo una mayor estabilidad del contenido de antocianos monómeros (Saucier at al., 1997; Morata at al., 2005). La afinidad y el ratio de consumo potencial por el oxígeno de las lías alcanza valores mucho más altos que por la fracción polifenólica del vino (Fornairon-Bonnenfond & Salmon, 2003). Las lías pueden competir notablemente con los polifenoles por el oxígeno (Salmon, 2005), lo que explica en parte la mayor estabilidad de la materia colorante y la menor degradación de antocianos en los vinos así envejecidos.
Los preparados comerciales de enzimas β-glucanasas autorizados para el uso en enología incrementan de forma muy considerable las concentraciones de polisacáridos, y se sintetizan y aíslan a principalmente a partir de especies deTrichoderma, cultivados bajo condiciones que optimicen su producción y aislamiento (Humbert-Goffard at al., 2004).
El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la liberación de polisacáridos de pared durante la lísis celular de cepas de levadura previamente seleccionadas seleccionadas de Saccharomyces, el efecto de la adición de enzimas β-glucanasas en la aceleración del proceso, y el efecto de la crianza sobre lías en la estabilidad del contenido de antocianos monómeros en un vino tinto elaborado con Vitis vinifera L. cv Tempranillo.

I.2. Materiales y métodos
I.2.1. Levaduras empleadas en el proceso experimental
Se emplearon las siguientes cepas de levaduras seleccionadas: 9CV, 5CV, 4CV, 7VA, 3VA, 2EV pertenecientes a la especie Sacch. cerevisiae, las cuales han sido aisladas y seleccionadas en el Laboratorio de Enología del Departamento deTecnología de Alimentos, UPM (Madrid, Spain), y también la cepa comercial S6U perteneciente a la especie S. uvarum (Lallemand, Danstar Ferment, Montreal, Canadá).
La biomasa de levadura para los ensayos de crianza sobre lías se obtuvo por fermentación de un medio YEPD (Kurtzman & Fell, 1998) enriquecido en glucosa hasta 100 g/L. Esta biomasa se lavó con volúmenes 10:1 de agua destilada estéril y se centrifugó (3000 rpm, 2 min) separando la biomasa del sobrenadante. La operación se repitió dos veces a fin de obtener una biomasa de levaduras sin restos de nutrientes. Posteriormente la biomasa de cada levadura multiplicada se liofilizó y se conservó refrigerada a 4 ºC.
I.2.2. Autolisis en medios sintéticos
Para cuantificar la cesión de polisacáridos se simularon crianzas sobre lías en un medio modelo compuesto por solución hidroalcohólica (agua:etanol, 90/10, v/v) acidulado a pH 3,5 con ácido tartárico. Este medio se dosificó en matraces Erlenmeyer de 100 mL a razón de 50 mL.
La cesión de polisacáridos fue estudiada utilizando las siete cepas de levadura previamente seleccionadas para la crianza sobre lías en vinos tintos, junto con un testigo sin levadura, y tres ensayos más a los que se añadió enzima β-glucanasa.
Sobre este medio modelo se adicionaron 0,8 g/L de levadura liofilizada. Los matraces se conservaron isotérmicamente a 30 ºC, y fueron sometidos semanalmente a agitación orbital, durante una hora, tratando de reproducir las condiciones de crianza reales en este tipo de crianzas.
I.2.3. Obtención de los polisacáridos a partir de los medios sintéticos
Los polisacáridos se recuperaron a partir de 1 mL de autolisado mediante precipitación en medio apolar ácido (etanol:HCl, 5 mL de Etanol 96 % v/v y 50 μl HCl 1 N). La precipitación se facilitó refrigerando a 4ºC durante 24 h; posteriormente se lavaron con 1 mL de etanol y se centrifugaron a 9000 rpm descartando el sobrenadante. Esta operación se repitió tres veces. El precipitado se deshidrató en estufa a 40 ºC. Finalmente se resuspendió en 1 mL de NaNO3 0,1 M, se filtró a 0,45 μm y se conservó refrigerado antes de su análisis HPLC-RI.
I.2.4. β-glucanasas
Las enzimas β-glucanasas adicionadas fueron LALLZYME MMX (Lallemand, Danstar Ferment, Montreal, Canadá) en dosis de 50 mg/L según lo recomendado por el fabricante.
I.2.5. Análisis de los polisacáridos mediante cromatografía líquida de alta presión con detección por índice de refracción (HPLC/RI)
Los polisacáridos se analizaron por cromatografía HPLC (Doco at al., 1996) mediante separación en columna de exclusión molecular ultrahidrogel 250 (Waters, MA), utilizando como eluyente NaNO3 0,1 M en agua MilliQ en régimen isocrático y detectando mediante índice de refracción (RI). El equipo utilizado fue un cromatógrafo Waters (Waters, MA) con bomba 600E, inyector 717p y detector IR 2412.
Para determinar el tamaño de los polisacáridos liberados durante la autolisis se utilizaron como marcadores patrones de pullulans (polymaltotriose) Shodex (Japan) de tamaño conocido: P-100 (112 KDa), P-50 (47,3 KDa), P-20 (22,8 KDa), P-10 (11,8 KDa), P-5 (5,9 KDa) (figura I.1). El contenido en polisacáridos de los cuantificó realizando una curva de calibrado con estándar externo utilizando los patrones de pullulanos anteriormente descritos.
Figura I.1. Elución de los patrones de pululanos según tamaños moleculares en HPLC-RI El contenido de polisacáridos en los ensayos de autolisis convencional en medio modelo fue determinado en los meses 1, 3, 5, 7 y 9. En los ensayos de adición de enzimas β-glucanasa el contenido de polisacáridos se determinó las semanas 1, 2 y 3.

I.2.6. Vinos
Se utilizaron vinos de Vitis vinifera L. cv. Tempranillo de la DO Ribera del Duero. El pH del mosto fue de 3,7 y el contenido azucarado 210 g/L. A los vinos se les añadieron dosis de 0,3 g/L de levadura liofilizada y se estudió la evolución del contenido de antocianos monómeros durante 420 días.
I.2.7. Análisis de antocianos mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC-PDAD)
Los antocianos contenidos en los vinos fuerona analizados utilizando un cromatógrado HPLC Waters (Mildford, MA, USA) equipado con una controladora 600-MS, un inyector automático 717 Plus y un detector de fotodiodos 996.
Se utilizó un gradiente de disolventes A (agua/ácido fórmico, 90:10, v/v) y B (metanol) en una columna de fase reversa Nova-Pak C18 (300 x 3,9 mm). Se inyectaron volúmenes de muestra de 100 µL previamente filtrados mediante filtros de acetato de celulosa de 0,45 µm de diámetro de poro.
I.2.8. Medida de la intesidad de color y porcentaje de color
Se ha medido la absorbancia de los vinos a 420, 520 y 620 nm en un espectrofotómetro JASCO V-530 (Jasco, Japón) en una cubeta de cuarzo de 1 mm de longitud de paso de luz, siguiendo la metodología propuesta por Glories (Glories, 1984 a; Glories, 1984 b). Se calcularon la intensidad, tonalidad, y porcentajes de rojo, amarillo y azul.
I.2.9. Análisis estadísticos
Las medias, desviaciones estándar, ANOVAs y diferencias mínimas significativas se han calculado utilizando el software para PC Statgraphics 5.0 (Graphics Software Systems, Rockville, MD, USA).

I.3. Resultados, tratamientos estadísticos y discusión
I.3.1. Liberación de polisacáridos durante la crianza en medio sintético utilizando levaduras seleccionadas
La tabla I.1 muestra el contenido de polisacáridos existente el mes 1º, 3º, 5º, 7º y 9º de un período de crianza sobre lías en medio modelo de 9 meses observándose que en todos los ensayos siguen una tendencia creciente y que es un proceso lento. Aunque se ha estudiado la posible existencia de diferencias entre las cepas utilizadas y se ha comprobado que son significativas para cada mes entre algunas de ellas (p<0.05), los resultados no son consistentes para las mismas levadura a lo largo de todo el período de autolisis, por lo que no se puede extrapolar que entre las cepas estudiadas existan levaduras de autolisis más rápida.

Tabla I.1: Polisacáridos liberados por las cepas de levaduras estudiadas en autolisis convencional en los meses 1, 3, 5, 7 y 9. Los valores son las medias y se acompañan de las desviaciones estándar (n=3)
Cepas
Expresado como mg/L de pululanos
1
3
5
7
9
S. cerevisiae9CV
0,13±0,23a
11,03±1,60b
9,47±0,91a
16,43±1,61a
36,83±4,40c
S. cerevisiae5CV
0,10±0,17a
9,53±0,38b
12,43±0,95b
17,07±1,60a
27,83±2,97b
S. cerevisiae4CV
0,23±0,11a
8,77±0,40b
12,33±2,56b
17,87±1,87a
23,67±0,73ab
S. cerevisiae7VA
0,37±0,06a
9,47±0,70b
12,57±0,38b
17,60±2,22a
21,77±1,58a
S. cerevisiae3VA
1,13±0,58b
9,33±1,70b
12,30±0,75b
24,63±4,69b
26,93±3,78b
S. cerevisiae2EV
0,07±0,11a
9,53±0,60b
12,57±0,40b
22,90±0,95b
26,17±1,05ab
S. uvarum S6U1,13±0,11b4,57±2,34a11,30±1,13ab18,20±2,01a21,67±1,33a
Los valores de la media en las misma columna y con la misma letra no son significativamente diferentes (p<0,05).

La elución de polisacáridos sucede desde el minuto 7 al 10,5 y aunque no hay diferenciación a línea de base por no ser una técnica de alta resolución. Se observa un pico claro a aproximadamente 7,3 minutos y otros menos marcados a 8,4 y 9,5 minutos (líneas de trazo continuo en figura I.2). Comparando con los marcadores de peso molecular estas bandas corresponden aproximadamente a 120.000, 23.000 y 7.000 Daltons (Morata at al., 2005). Esto es consistente con la forma aleatoria de rotura de la pared que hace que exista una sucesión de fragmentos de diverso tamaño. También se observa que la mayor cantidad de polisacáridos presentes en el noveno mes de autolisis corresponde a fragmentos de tamaño elevado (120.000-100.000 Da).
Figura I.2. Cromatogramas HPLC-RI de los extractos de polisacáridos de la cepa 9CV en los ensayos de autolisis sin enzimas glucanasas (azul) y con glucanasas (amarillo), ambas por triplicado. Se muestran también como bandas los tiempos de retención al que eluyen los marcadores de peso molecular utilizados (pululanos).


El estudio de la liberación de polisacáridos por HPLC-RI es complicado ya que esta técnica cromatográfica no tiene tan alta resolución como la cromatografía de fase reversa. La separación se realiza por tamaños eluyendo a tiempos más cortos los polímeros de mayor tamaño y a continuación los más pequeños. La separación no es en polímeros de igual tamaño sino que un pico agrupa polímeros de tamaño más o menos próximo.
El otro problema que dificulta el análisis proviene de lo que se está estudiando, que son fragmentos de pared celular rotos aleatoriamente cuando se autolisan las levaduras. Por tanto se va a obtener una sucesión de tamaños de distribución irregular. La pared celular de Saccharomyces cerevisiae es la cubierta celular exterior y se compone de polisacáridos y manoproteínas de tamaño variable entramadas por fibras de quitina y glucano (Pretorius, 2000).
Las condiciones anteriores hacen que la repetibilidad entre dos ensayos de autolisis en los que se ha puesto la misma biomasa de la misma cepa de levadura no sea tan alta como en otros métodos cromatográficos y las desviaciones estándar entre replicados sean altas. Esto es lógico por el carácter aleatorio del proceso de rotura de las paredes celulares en el cual influirán la mayor o menor resistencia estructural de cada levadura en las condiciones de daño mecánico producidas por la agitación, a la temperatura y a la liberación de enzimas líticas de la dotación enzimática de cada cepa.
I.3.2. Efecto de la adición de enzimas β-glucanasas
La adición al medio modelo enzimas β-glucanases acelera de forma notable el proceso consiguiéndose cantidades de polisacáridos iguales o superiores en dos semanas a las obtenidas sin enzimas después de 9 meses de autolisis (tabla I.2). Cuando se utilizan enzimas la repetibilidad entre replicados es más elevada y se obtienen desviaciones estándar más bajas. Al utilizarse enzimas el proceso es menos aleatorio y la lísis se completa de forma más regular. La primera semana prácticamente no existe autolisis (1.3-3.9 mg/L) valor a tiempo inicial en el cual la enzima no ha debido actuar suficientemente. A partir de la segunda semana ya existe un proceso de lísis enzimática muy importante que da lugar a una notable liberación de polisacáridos para todas las cepas de levadura estudiadas.
Tabla I.2: Polisacáridos liberados por las cepas de levaduras estudiadas en autolisis en presencia de β-glucanasas en las semanas 1, 2 y 3. Los valores son las medias y se acompañan de las desviaciones estándar (n=3)
Cepas
Expresado como mg/L de pululanos
1
2
3
S, cerevisiae 9CV
2,70±0,96b
34,87±4,69abc
57,20±10,44a
S, cerevisiae 5CV
2,50±0,90b
37,43±0,96bc
61,30±10,29ab
S, cerevisiae 4CV
3,87±0,71c
44,63±3,68c
71,87±16,24ab
S, cerevisiae 7VA
1,83±0,06ab
27,90±3,83ab
53,10±5,44a
S, cerevisiae 3VA
1,37±0,49a
25,63±4,96a
53,80±6,50a
S, cerevisiae 2EV
1,90±0,26ab
68,80±11,38d
111,60±14,06c
S, uvarum S6U
1,30±0,17a
35,80±6,94abc
78,77±13,70b
Los valores de la media en la misma columna y con la misma letra no son significativamente diferentes (p<0,05).


En general, el proceso utilizando enzimas comerciales es similar para las levaduras estudiadas excepto para la cepa 2EV que presenta una mayor cantidad de polisacáridos terminando con 111,6 mg/L mientras que el resto se encuentran en el rango 53,1-78,8 mg/L. Las diferencias entre la cepa 2EV y el resto son significativas para las semanas 2 y 3 (tabla I.2).
Otro hecho importante es que aunque la lísis enzimática de la pared celular es mucho más rápida, el efecto que se consigue no es igual, ya que los fragmentos de polisacáridos tienen un tamaño más regular y son más pequeños observándose enfigura I.1 que existe una banda centrada en RT 8,2 min y que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 35.000 Da. El contenido de polisacáridos de tamaño superior (120.000) e inferior (7000) es mucho menor que en la autolisis convencional, resultado lógico ya que ahora la β-glucanase hidrolíza las fibras de glucano de forma menos aleatoria y más regular liberando fragmentos de tamaño más homogéneo.
La repercusión a nivel sensorial de este hecho debe estudiarse más profundamente ya que polisacáridos de menor tamaño pueden producir una sensación táctil en boca menos perceptible que la que producen los polisacáridos de tamaño superior liberados en la autolisis convencional. Por otra parte la estabilidad coloidal de los vinos enriquecidos con polisacáridos procedentes de lisis con β-glucanasa puede que sea mayor al ser estos de menor tamaño y por tanto menos proclives a precipitar.
I.3.3. Identificación de antocianos y piranoantocianos mediante
HPLC-PDAD
Normalmente la crianza de vinos tintos supone una pérdida de antocianos monómericos, porque éstos se degradan o evolucionan hacia formas no coloreadas o bien se polimerizan hacia formas más estables. No obstante en la crianza sobre lías no ocurre lo mismo, debido a que los polisacáridos y las manoproteínas liberados durante la autolisis ejercen un efecto protector sobre los antocianos monómeros de los vinos tintos jóvenes, lo que se traduce en una mayor persistencia de los colores rojoazulados.
La concentración de antocianos totales más alta es la de la primera medición, realizada a los 60 días (figura I.2). En esta fecha los ensayos con enzima β-glucanasas poseen una concentración en mg/L de antocianos totales un 30 % inferior con respecto a las muestras de crianza sobre lías y testigos (véase pico de M3G en figura I.3).
Figura I.2. Evolución de la concentración de antocianos totales para el testigo (gris) y en promedio para las muestras en crianza sobre lías de todas las cepas de levadura estudiadas con (negro) y sin enzimas β-glucanases (rojo). Los valores son las medias y se acompañan de las desviaciones estándar como barras de error (n=3).

El empleo de preparados comerciales de enzimas β-glucanasas supone una considerable reducción en la concentración de antocianos monómeros, probablemente porque las enzimas comerciales no son totalmente puras y presentan enzimas β-glicosidasas en pequeñas cantidades que puedan hidrolizar la glucosa que esterifica los antocianos, liberando moléculas más inestables (Wrolstadat al., 1994; Wightman & Wrolstad, 1996).
Las tendencias de las tres muestras han evolucionado en paralelo desde la primera medida, lo que significa que debido probablemente a la desnaturalización de las enzimas β-glucanasas, su acción sobre el color decrece una vez pasado un período inicial de actividad, en este caso los dos primeros meses. Estrechamente ligadas en su evolución las muestras de crianza sobre lías y testigos manifiestan a partir de los 120 días trayectorias diferentes. Las muestras envejecidas en crianza sobre lías alcanzan concentraciones en antocianos totales mayores que los testigos a los 420 días, existiendo diferencias significativas entre ambos valores (figura I.3), cuya posible justificación radica en el carácter reductor de las lías.
Figura I.3. Cromatograma HPLC-PDAD, para el testigo y las muestras en crianza sobre lías con la cepa de levadura 7VA con y sin enzimas β-glucanasas. Determinadas el día 420 de crianza.
Según Rosenfeld (2003) y Foinairon & Salmon (2003) los índices en el consumo potencial de oxígeno de células viables de levaduras y lías son mucho más elevados que los de los polifenoles. Así, Vivas (2000) obtiene vinos menos oxidados cuando se han envejecido sobre lías, atribuyendo este efecto a la liberación de componentes celulares durante la autolisis de levaduras. También se ha observado que las lías impiden la oxidación de compuestos fenólicos durante el envejecimiento (Salmon, 2005). La liberación de polisacáridos durante la autolisis de levaduras y la competencia de las lías con los polifenoles por el oxígeno en las muestras en crianza sobre lías son los procesos responsables de la mayor estabilidad en el contenido de antocianos monómeros.
Por otro lado existe un período inicial hasta el cuarto mes en el cual ocurre una degradación mayoritaria con respecto a la total de antocianos. En este período los contenidos en antocianos totales merman sobre el total el 76,26 %, 66,24 % y el 76,34 % en los ensayos de crianza sobre lías, testigos y muestras enzimadas con β-glucanasas respectivamente.
I.3.4. Efecto de la crianza sobre lías en el contenido de pigmentos piranoantociánicos de elevada estabilidad
Las vitisinas son pigmentos de elevada estabilidad formados por condensación de antocianos y metabolitos liberados al medio durante la fermentación. Las vitisinas son más resistentes a la decoloración por anhídrido sulfuroso que otros antocianos (Bakker & Timberlake, 1997), y expresan colores más intensos que otros pigmentos a pH 4 (Atanasova at al., 2002). También, se ha demostrado la elevada correlación existente entre las cantidades cedidas al medio fermentativo de piruvato y acetaldehído, y la formación de vitisinas A y B respectivamente (Morata at al., 2003). La adición de piruvato y acetaldehído incentiva la formación de vitisinas A y B (Morata at al., 2007; Hayasaka at al., 2002; Romero at al., 2000).
En la figura I.4, se muestran las tendencias en la evolución del malvidin-3-O-glucósido y de la vitisina A. En dicha gráfica se pone de manifiesto la elevada permanencia y menor degradación de pigmentos piranoantociánicos como la vitisina A, frente a antocianos glucósidos como el malvidin-3-O-glucósido. Mientras que la evolución en los contenidos en malvidin-3-O-glucósido sigue una tendencia análoga a la anteriormente vista de antocianos totales, la concentración de vitisina A se mantiene constante a lo largo del período de crianza sobre lías.
Llama especialmente la atención el comportamiento de ambos pigmentos en las muestras tratadas con β-glucanases. En ellas la vitisina A tiene un comportamiento mucho más persistente que el malvidin-3-O-glucósido, lo que revela una menor degradación de color cuando se utilizan enzimas aceleradoras del proceso de autolisis. Esto puede justificar la selección de cepas de levadura productoras de altos contenidos de ácido pirúvico y acetaldehído para inducir la síntesis de estos pigmentos, especialmente en las condiciones de crianza sobre lías; contenidos importantes de anhídrido sulfuroso y pH elevado.

Figura I.4. Evolución en las concentraciones de malvidin-3-O-glucósido y vitisina A para el testigo y las muestras en crianza sobre lías con la cepa de levadura 4CV con y sin enzimas β-glucanasas. Los valores son las medias y se acompañan de las desviaciones estándar como barras de error (n=3).


Existen otros pigmentos de elevada persistencia y cuya evolución en el vino está íntimamente ligada a los procesos de crianza sobre lías, como son los derivados vinilfenólico piranoantocianina (VPH). Los antocianos monómeros condensan de forma natural con vinilfenoles, originados en el vino por la descarboxilación de ácidos hidroxicinámicos, especialmente cuando se utilizan levaduras con actividad hidroxicinamato descarboxilasa (Morata at al., 2006). La gran estabilidad de estos pigmentos se debe a su cuarto anillo heteroaromático que permite la deslocalización de la carga positiva del antociano en dos moléculas de oxigeno. Asimismo estos pigmentos son más resistentes a decoloraciones por SO2 y a reducciones en la intensidad colorante a pH elevados ya que la condensación a partir de la cual se forman implica el bloqueo de la posición 4 del antociano.
La progresiva formación de vinilfenoles a lo largo de la crianza se solapa con el proceso de condensación anteriormente mencionado. La acción enzimática de las β-glucanasas supone grandes pérdidas en las concentraciones de antocianos totales, aunque la degradación sobre derivados más estables como vitisinas o aductos vinilfenólicos sea mucho menor (figura I.4).
En la formación de vinilfenoles, no se apreciaron grandes diferencias entre los diferentes ensayos. Los ácidos hidroxicinámicos se encuentran en el vino previamente al proceso de crianza, acumulándose en la baya antes del envero o bien formándose gracias a cepas de levadura hidroxicinamato decarboxilasa positivas. De esta forma la concentración de precursores en todas las muestras similar, lo que explica las escasas diferencias en las concentraciones de vinilfenoles.
4. Conclusiones
La crianza sobre lías de vinos tintos es una técnica que permite mejorar la estructura y densidad de los vinos incrementando sus caracteres sensoriales gustativos gracias a la liberación de polisacáridos. También permite una estabilización del contenido de antocianos monómeros lo que favorece una mayor estabilidad de color. La utilización de enzimas β-glucanasas reduce de forma importante el tiempo de crianza sobre lías pero se liberan polisacáridos de menor tamaño molecular y las preparaciones comerciales poseen actividades β-glicosidasa residuales que afectan negativamente al contenido de antocianos. La utilización de levaduras seleccionadas para vinificación en tinto y de rápida autolisis, en crianza sobre lías puede permitir un desarrollo más rápido y efectivo de esta técnica y reducir los inconvenientes de posibles contaminaciones y desviaciones organolépticas.

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15/5/15

Levaduras vínicas


Rosa Isela Viramontes Álvarez1 y Ramona Pérez Leal2
1Estudiante de Maestría en Ciencias de la Productividad frutícola, Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua
2 Catedrático de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua
rviramontesa@yahoo.com.mx 
Desde la antigüedad diferentes culturas y civilizaciones de todo el mundo han usado sin saberlo levaduras. Lo hicieron fermentando de forma natural sus panes y bebidas alcohólicas, por lo que se pensaba que era algo misterioso y mágico. Esta idea comenzó a cambiar gracias a la ciencia con la intervención de Louis Pasteur, quién a mediados del siglo XIX probó que la fermentación alcohólica era hecha por levaduras y no por un catalizador químico que era lo que se había pensado hasta entonces. El trabajo de la levadura en este proceso es consumir azúcares para producir dos productos importantes: CO2, que es dióxido de carbono, y etanol. Además de esto, produce otros productos químicos en pequeñas cantidades, que es lo que le da a las diferentes bebidas sus diferentes sabores tan peculiares dependiendo de la levadura usada.
Tradicionalmente, la producción de vinos se ha realizado a partir de fermentaciones de los mostos, llevadas a cabo por cepas de levaduras endémicas residentes en las superficies de las uvas y de los equipos de las bodegas (Escalante et al. 2007) aunque se ha demostrado también que viven en asociación con la vid, hallándose usualmente sobre la corteza, las hojas, las flores y en la pruina de la baya. Y que su crecimiento sobre la superficie de las bayas está determinado por diversos factores ambientales, como la temperatura y la humedad, así como por el grado de madurez y el estado de salud (Claudia et al. 2007). La fermentación con estas levaduras endémicas se llama fermentación espontánea y son de gran importancia ya que con ellas consiguen características organolépticas típicas de la zona, que no estarían presentes si se utilizara un inóculo de cepas foráneas. Sin embargo la calidad del producto puede ser muy variable (Escalante et al. 2007).
La actividad metabólica de los diferentes géneros y especies de levaduras presentes en la superficie de las uvas en el viñedo, y capaces de resistir las condiciones de vinificación, influencian la calidad sensorial del vino obtenido. Siendo estas las especies Hanseniaspora uvarum (y su forma anamorfa Kloeckera apiculata) de 50-75% de la población total de levaduras aisladas, y en menor población se han encontrado presentes los géneros Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia y Rhodotorula, (Carrau 2005, Berradre et al. 2012, Esteve-Zarzoso et al. 1998, Di Maio et al. 2012). En la tabla 1se muestran con más detalle cuáles son las levaduras relacionadas a la uva y el vino. Su crecimiento se limita generalmente a los dos o tres primeros días de fermentación, después de lo cual mueren. Posteriormente, la fermentación con más fuerza y más especies tolerantes al etanol de Saccharomyces se hacen cargo de la fermentación (Esteve-Zarzosoet al. 1998). Aunque contrario a lo que se pensaba, las especies fermentativas deSaccharomyces se han aislado en muy baja población sobre uvas sanas y han sido extrañamente aisladas de granos de uva intactos y de suelos de viñedos (Berradre et al. 2012). Antes de la maduración, las uvas están casi libre de S. cerevisiae (~ 0,05%), mientras que el 25% de las uvas maduras albergan tales levaduras. Por lo que esto sugiere que S. cerevisiae no se encuentre en el aire, y que requiere un vector para moverse, probablemente animales, insectos como abejas y avispas (Stefanini et al. 2012).

Tabla 1. Especies de levaduras relacionadas a la uva y el vino
Se ha comprobado que estas especies fermentativas están asociadas con el área de la bodega y que son incorporadas dentro del mosto durante el tratamiento mecánico de la uva y el proceso de fermentación, (Berradre et al. 2012). La acción secuencial de estos diferentes géneros y especies de levadura, contribuyen al aroma y sabor de los vinos, determinando la calidad de estos. El aroma y el sabor están dados por los compuestos volátiles formados durante la fermentación incluyendo alcoholes, ésteres, ácidos orgánicos, fenoles, tioles, monoterpenos y norisoprenoides. Entre los compuestos volátiles derivados del metabolismo de la levadura se encuentran los ésteres, alcoholes y acetatos, que en diferentes combinaciones afectan la calidad del vino (Vilanova y Sieiro 2006, Hyma et al. 2011).
Estudios en los que se han investigado cultivos iniciadores y levaduras nativas han demostrado que existen diferencias significativas en la composición química de los vinos resultantes, (Vilanova y Masneuf- Pomarède 2005) Las levaduras del mosto de uva en el inicio de la fermentación del vino se pueden dividir a grandes rasgos en dos grupos, es decir, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y las levaduras no-Saccharomyces. Las levaduras deSaccharomyces se derivan principalmente de los equipos de bodega y en muy bajo número en la uva. Las levaduras no-Saccharomyces, se encuentra predominantemente en las uvas, pero también en menor número en el equipo de bodega, (Jolly et al. 2003). Por lo que en la trituración de la uva, y las condiciones ambientales específicas en el mosto, es decir, la presión osmótica alta, la presencia de SO2, la temperatura y la higiene bodega, todos juegan un papel en la determinación de las especies que pueden sobrevivir y crecer en el mosto, (Jolly et al. 2003).
Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así como por su capacidad de producir etanol, (Folch et al. 2004). Filogenéticamente de las cepas deSaccharomyces cerevisiae se ha encontrado que la especie en su conjunto consta de dos poblaciones, domésticos y salvaje (Schuller et al. 2012, Hyma et al. 2011). Algunas características de esta levadura que forman parte de su adaptación son el hecho de que pueda metabolizar la glucosa y la fructosa tanto por vía respiratoria como por vía fermentativa, y de crecer en condiciones aerobias o anaerobias (González et al. 2007). Siendo la fórmula simple de fermentación la siguiente (Garcia, 2008):
Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura más importante en microbiología del vino. Es mejor modelo industrial conocido por su miembro, la levadura S. cerevisiae, pero comprende además ocho especies estrechamente relacionadas. La opinión común coincide en que esta especie es un producto de la domesticación (Gonçalves et al. 2011). En particular se han realizado muchos estudios respecto al comportamiento y características bioquímicas, moleculares y bióticas de esta levadura. Los estudios relacionados con S. cerevisae y su rol en la fermentación han sido, por ejemplo, la caracterización por métodos moleculares, en relación a sus propiedades enzimáticas, modificación genética para producir otras enzimas, detección rápida de los cambios en la población durante los procesos, la detección de otras levaduras que actúan contra S. cerevisae o en sinergia con ella para mejorar el aroma, evaluación de factores nutricionales que afectan su comportamiento o de fracciones celulares que protegen el proceso, etc. (Rojas et al. 2005).
Tiene gran capacidad de crecer en el zumo de uva, que se caracteriza por un alto contenido de azúcares y bajo contenido de sustancias de nitrógeno. La especie produce altas cantidades de etanol a la vez que consume el contenido de azúcares y baja el pH (Tiago et al. 2012) que inhiben el crecimiento de cepas no- Saccharomyces (Cocolin et al. 2004). Además de poseer el fenómeno killer, que implica la secreción, por parte de ciertas cepas, de una proteína tóxica de baja masa molecular, llamada toxina killer, a la cual ellas son inmunes, que mata a células sensibles, las cuales pueden ser del mismo o diferentes géneros. Este tipo de interacciones pueden determinar la evolución de las distintas poblaciones de levaduras durante la fermentación. En algunas ocasiones una cepa killer deSaccharomyces cerevisiae predomina al final del proceso fermentativo, sugiriendo que la expresión de la toxina le permitió conducir parte de la vinificación. Este fenómeno killerpueden ser un método alternativo para el control de levaduras no deseadas, (M.C. Nally et al. 2005, Maqueda et al. 2012).
Estas levaduras también están presentes en el envejecimiento de vinos formando una película llamada velo de flor, por lo que se llaman levaduras flor, Su crecimiento en la superficie produce cambios importantes en las características del vino debido a su metabolismo oxidativo (Esteve-Zarzoso et al. 2001).
Las fermentaciones también son impulsadas en gran medida por inoculaciones de una sola cepa pura de S. cerevisiae seleccionada por el enólogo, que se añade al mosto de uva, después de la molienda. Para asegurar un mayor control de la vinificación, se obtienen resultados más predecibles y disminuye el riesgo de deterioro por otros microorganismos (Chambers et al. 2010). Las levaduras seleccionadas se han utilizado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de calidad más uniforme que los que se producían con las fermentaciones espontáneas (Mas et al. 2006).
Al seleccionar levaduras comerciales se deben tener en cuenta las propiedades de estas y las características del vino que se quiere producir, tales como la concentración de metabolitos que toleran o se precisan para iniciar con éxito la fermentación, o la temperatura óptima de desarrollo: la mayoría lo hace entre 12 y 36º C; si la temperatura óptima es menor de 30º se denominan criófilas, si se encuentra entre 25 y 35º son mesófilas, y si la temperatura a la que se desarrolla preferentemente es mayor de 35º C se denominan termófilas (Bartra 2000).
A pesar de esto, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona vitivinícola donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son:
• Específicas del área.
• Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona.
• Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar.
• Responsables, al menos parcialmente, de las características únicas de los vinos obtenidos (Mas et al. 2006).
Para hacer una selección de levaduras, el criterio dependerá del tipo de fermentación, estos criterios pueden ser los que muestra la tabla 2.
Tabla 2. Algunas de las características deseables y no deseables en la selección de levaduras para la producción de vinos de calidad
No- Saccharomyces
Las levaduras no- Saccharomyces en la producción de vino se han considerado principalmente como organismos de descomposición. Los metabolitos de descomposición más importantes producidos por estas levaduras son el ácido acético, acetaldehído, acetoína y acetato de etilo, junto con malos olores, tales como el vinilo y etilfenoles que están relacionados con el desarrollo de Brettanomyces / Dekkera spp (Ciani et al. 2009). Afirmando además, que murieron durante las etapas iniciales de la fermentación debido a la toxicidad de la concentración de alcohol al aumentar el metabolismo de Saccharomyces cerevisiae (Jolly et al. 2003, Esteve-Zarzoso et al. 1998). Aunque se ha demostrado que algunas sobreviven durante la fermentación, y que además los metabolitos formados por algunas especies no- Saccharomyces pueden contribuir a la calidad del vino, por ejemplo la producción de glicerol por Candida stellata y la producción de éster por Candida pulcherrimaque, en algunos vinos pueden tener una influencia positiva en la calidad del vino. Otras especies, tales como Kloeckera apiculata, se asocian con la producción de ácido acético que puede ser perjudicial para la calidad del vino. Algunas especies no- Saccharomyces también poseen actividad ß-Glucosidasa que pueden hidrolizar los precursores del aroma, (Jolly et al. 2003). Por lo que la actividad inicial de las levaduras no- Saccharomyces en el mosto de fermentación se considera importante para el perfil final de compuestos aromáticos de los vinos, debido a que estas levaduras son responsables de diferentes reacciones enzimáticas en el desarrollo de una amplia gama de los productos finales volátiles y no volátiles (Romancino et al. 2008). La producción de exo y endonucleasas por estas levaduras juega un papel muy importante, como lo son las pectinasas que tiene algunas aplicaciones de clarificación, filtración y también la extracción de color del vino. El uso de enzimas pectolíticas para la maceración también puede aumentar el contenido en jugo de terpenol. Otras enzimas son las esterasas formadoras de compuestos del aroma del vino y las lipasas que degradan los lípidos procedentes de la uva (Esteve-Zarzoso et al. 1998).
Fermentaciones mixtas
Usando cultivos de Saccharomyces cerevisiae y levaduras no- Saccharomyces representan una forma viable hacia la mejora de la complejidad y la mejora de las características particulares y específicas de los vinos. Las posibles interacciones sinérgicas entre diferentes levaduras pueden proporcionar una herramienta para la aplicación de las nuevas tecnologías de fermentación. Por lo tanto, el conocimiento de la interacción de estas levaduras durante la fermentación del vino necesita ser mejorado. Se ha demostrado que cuando algunas levaduras se desarrollan juntas en condiciones de fermentación, no lo hacen pasivamente, sino más bien interactúan (Ciani et al. 2009). En la tabla 3 se muestran algunas interacciones.
Tabla 3. Procesos de fermentación mixtos que se han propuesto en la vinificación, utilizando levaduras Saccharomyces cerevisiae y no-Saccharomyces
La importancia de las levaduras es su acción sobre la composición y también ejercen un efecto sobre el perfil aromático del vino. Es importante considerar también que durante la fermentación alcohólica, la levadura produce aromas fermentativos, lo mismo que sucede cuando puede actuar sobre el color, la textura y el perfil aromático de los vinos. Por lo que su elección en fermentaciones inoculadas debe ser teniendo en cuenta el perfil de producto que se desea obtener. Y en el caso de las fermentaciones espontáneas es de suma importancia conocer la diversidad de la población de levaduras nativas en el entorno para el monitoreo de la fermentación.
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