11/9/15

Levadura no Saccharomyces

Las levaduras de Saccharomyces para modular el aroma del vino: el aumento de acetato de 2-fenetil utilizando cultivos iniciadores mezclados  
José Gil Vicente, 1,2  Fernando Viana 1  y Paloma Manzanares 1 1  Departamento de Biotecnología Alimentaria, Instituto de Química Agrícola y Tecnología de los Alimentos, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IATA-CSIC), Paterna, Valencia 2 Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Medicina Legal y Toxicología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Valencia, Burjassot, Valencia
 
La obtención de vinos más atractivo y complejo desde el punto de vista sensorial con el fin de satisfacer las necesidades del mercado global de hoy es uno de los objetivos prioritarios para los profesionales de la enología, exigiendo nuevos y mejores cepas de levadura adaptadas a diferentes tipos y estilos de vino. Esta demanda puede satisfacerse a través de la selección de la elaboración del vino en la levadura Saccharomyces y su inclusión en cultivos iniciadores mixtos, capaces no sólo de llevar a cabo la fermentación alcohólica, pero la introducción de características aromáticas diferenciales resultantes vinos.  
Durante la fermentación alcohólica levaduras no sólo convertir azúcares en etanol y dióxido de carbono, sino también producir toda una serie de metabolitos volátiles que aunque minoritaria, el vino aromático determinado carácter tan fundamental (Figura 1). El perfil aromático de un producto tan complejo como el vino no es atribuible a un solo impacto compuesto, pero es el resultado de la combinación y la interacción entre los diferentes compuestos aromáticos. Sin embargo, el fondo genérico aroma se atribuye principalmente a los alcoholes y ésteres que le dan su calidad e intensidad aromática.
Fig 1
Figura 1.  La formación de compuestos aromáticos durante la fermentación alcohólica. (Fuente: Red Comprobador 2002). [Haga clic en la imagen para ampliar]
 

Ésteres, compuestos volátiles con fragancias aromáticas agradables, se generan en pequeñas cantidades, pero a una concentración superior a su umbral de percepción. Los más importantes son los ésteres polares, responsables de dar al cuerpo vino y consistencia, y ésteres no polares, que incluyen ésteres de acetato de alcoholes superiores y ésteres etílicos de ácidos grasos saturados. En general, los ésteres no polares asociados con el aroma afrutado, floral y fresco en los vinos jóvenes (Tabla 1).

Ésteres Tabla 1. Concentración de vino, los umbrales de detección y aroma formadas por grandes S. cerevisiae durante la fermentación alcohólica 
Tabla 1
Varios estudios han documentado la capacidad de las levaduras en Saccharomyces para sintetizar ésteres de acetato. Por ejemplo, su capacidad para sintetizar acetato de etilo es generalmente mayor que las cepas de vinoso Saccharomyces cerevisiae, y ciertos géneros tales como Rhodotorula, Pichia y Hansenispora han sido identificados como buenos productores de acetato de isoamilo y acetato de 2- feniletilo. Además, estos estudios han demostrado que la levadura en Saccharomyces puede ser seleccionado basado en su capacidad para producir metabolitos secundarios que contribuyan a mejorar la calidad del vino.          
En este contexto, nuestra propuesta para conferir vinos aromáticos mayor complejidad ha sido la selección de levaduras en Saccharomyces que, como parte de los cultivos mixtos con S. cerevisiae, son capaces de aumentar la concentración de acetato de 2-fenetilo, ya que este compuesto se asocia con un aroma afrutado, floral y miel notas y tabaco (Viana, 2011).    
Escrutinio de las cepas: la importancia de los criterios de selección
Las levaduras en Saccharomyces tradicionalmente se han asociado a la formación de ésteres de acetato, especialmente acetato de etilo, cuya negativo impacto en la calidad del vino cuando superan ciertos niveles (de 150-200 mg / L) llevó a etiquetar estas levaduras como deterioro. Sin embargo, la producción de estos compuestos es dependiente de la cepa, por lo que un criterio de selección racionales permiten levaduras identificar los más apropiados.  
Nuestra propuesta para una estrecha vigilancia microbiológica en medio se utilizó como criterio la capacidad de combinar la alta producción de acetato de 2-fenetilo con bajos niveles de acetato de etilo. La proyección se realizó con 38 cepas de levadura vinoso, pertenecientes a la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Se incluyeron especies de Candida (C. Cantarell, C. Dattilo y C. stellata), Hanseniaspora (H. guilliermondii, H. uvarum y H. manteletes), Pichia (P. anomala, P. fermentans y P. membranifaciens) Torulaspora (T. delbrueckii) y Zygosaccharomyces (bailii Z y Z. rouxii). Para fines de comparación, también se incluyen en el estudio de 9 cepas comercial S. cerevisiae. Como resultado de este control (Figura 2), se seleccionaron 4 cepas de levadura pertenecientes a los géneros Hanseniaspora y Pichia (H. guilliermondii 11027 y 11102, H. manteletes 1471, P. membranifaciens 10550).                              
Fig 2
Figura 2.  Producción de acetato de etilo (representado como área) y acetato de 2-feniletilo (círculos negros). Las cuatro cepas seleccionadas están marcados con un asterisco (4: Pichia membranifaciens 10.550; 9: Hanseniaspora manteletes 1471; 11: Hanseniaspora guilliermondii 11027; 17: Hanseniaspora guilliermondii 11102). (Fuente: Adaptado de Viana et al., 2008) [Haga clic en la imagen para ampliar]           

El segundo criterio de selección fue la baja producción de H2S y vinilo y etilfenoles a través de actividades reductasa sulfito y descarboxilasa cinamato, ya que estos compuestos están impactando en la calidad del vino. Actividad de la reductasa de sulfito no se detectó en la cepa de P. membranifaciens, pero en las tres cepas de Hanseniaspora, aunque a niveles similares a los detectados en cepas comerciales de S. cerevisiae. La actividad descarboxilasa de cinamato no se detectó en ninguna de las cepas seleccionadas. Así que siguió adelante con las 4 cepas para completar la caracterización.   
."El ácido acético puede inhibir el crecimiento de S. cerevisiae, (...). Este efecto inhibidor también se asocia con concentraciones excesivas de ácidos grasos de cadena corta, capaces de provocar paradas de fermentación. »  
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Con el fin de seleccionar la cepa más adecuada para formar parte de un cultivo iniciador mezclado con S. cerevisiae, el tercer criterio de selección fue el perfil vino. Este perfil incluye el consumo de glucosa y fructosa, debido a su posible efecto sobre el comportamiento de fermentativa S. cerevisiae debido a su glucofílica naturaleza. Del mismo modo también vio la formación de etanol, acidez volátil, acetaldehído, ésteres de cadena corta de ácidos grasos de glicerol y alcoholes superiores. Específicamente, el ácido acético, al tiempo que un problema sensorial cuando su concentración se aproxima a su umbral de detección (0,7 a 1,1 mg / L), también puede inhibir el crecimiento de S. cerevisiae, aunque esto es concentraciones necesarias significativamente mayor (4.5 hasta 7.5 g / l). Este efecto inhibidor también se asocia con concentraciones excesivas de ácidos grasos de cadena corta, capaces de provocar paradas de fermentación.    
Las levaduras evaluadas, P. membranifaciens 10550 se descartó por su incapacidad para crecer vino. Las tres cepas restantes, en mayor o menor medida, el jugo fermentado y los niveles de acetaldehído, glicerol y ácido decanoico ligeramente más baja que producen los niveles producidos por S. cerevisiae, mientras que los niveles de ácido hexanoico y octanoico y la concentración de alcoholes superiores eran notablemente inferior en S. cerevisiae, de modo que estos compuestos no se consideraron criterio decisivo para la exclusión. La producción de ácido acético se coloca en el rango de 0,57 a 1,09 g / L, correspondiente al valor más alto en H. guilliermondii 11.102, por lo que se descartó. Por último, la formación de acetato de etilo y 2-feniletilo nos condujo a seleccionar el H. manteletes 1,471 mil (acetato de etilo: 39,9 mg / L; de etilo y 2-fenetilo 12,9 mg / L) frente a H. guilliermondii 11027 (acetato de etilo: 114,8 mg / L; de etilo y 2-fenetilo 1,55 mg / L) para formar parte de un cultivo iniciador mixto.           
Prueba de Concepto en el mosto de diseño estéril cultivo iniciador mixto
Una vez seleccionado H. manteletes 1471, dirigió el diseño de cultivos iniciadores mezclados. Para ello, se evaluaron diferentes iniciadores incluidos basan en la relación cerevisiae y S. cerevisiae que es común en el inicio de la fermentación espontánea (90: 10,% H. manteletes:% S. cerevisiae), así como los cultivos que se fue reduciendo progresivamente el porcentaje de H. manteletes (75:25, 50:50, 25:75, 10:90, 5:95 y 0: 100). El propósito de este objetivo fue diseñar cebadores más consistentes con la opinión del enólogo, que tiende a dar mejores cultivos que contienen altos porcentajes de S. cerevisiae.           
En vista de los resultados obtenidos (Figura 3), era posible reducir el porcentaje de H. manteletes hasta 50% sin comprometer el efecto beneficioso buscado, ya que la cantidad de acetato de 2-fenetilo obtenida fue significativamente mayor que la producida por S. cerevisiae.    
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Figura 3.  Concentración de acetato de etilo y acetato de 2-fenetilo en vinos producidos con el iniciador H.vineae: S. cerevisiae mediante la variación de la relación de las dos especies de levadura (1, 90:10; 2, 75:25; 3, 50:50; 4, 25:75; 5, 10:90; 6, 5:95, 7, 0: 100). El motor de arranque con el menor porcentaje de H. manteletes la producción de vinos con una concentración de acetato de 2-fenetil superior a la obtenida con S. cerevisiae en monocultivo se observó con un asterisco. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los datos (prueba de LSD, p <0,05). (Fuente: Adaptado de Viana et al., 2009. [Haga clic en la imagen para ampliar]        

Las pruebas indican que, en general, todos los parámetros de elaboración del vino, excepto el glicerol, se vieron afectados por la presencia de H. manteletes el iniciador. Se observó una relación lineal positiva con el porcentaje de concentraciones de levadura de acético, isobutanol, acetato de etilo y acetato de 2-fenetilo, mientras que era negativo para cadena de ácido graso corto, etanol 2-fenilo, propanol y ésteres etilo.  
Otra de las conclusiones extraídas de estos experimentos fue que, independientemente de su cuota inicial, H. manteletes fue capaz de crecer en presencia de S. cerevisiae similar a su crecimiento en cultivo puro. En nuestras condiciones de fermentación, la población de H. manteletes declinó después de alcanzar un pico después de 2 días de fermentación, a casi cero a ocho días, con la excepción de los vinos inoculados con el porcentaje más alto. Tradicionalmente, se ha asociado desaparición de levaduras en Saccharomyces, en particular del género Hanseniaspora después de los primeros 3-4 días de fermentación, con su baja tolerancia a etanol. Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, hay más y más estudios que muestran que la levadura pueden sobrevivir alcanzó su punto máximo a lo largo de la fermentación alcohólica durante períodos mucho más largos que originalmente descrita.        
  
Prueba de concepto en el jugo de uva natural: influencia del tipo de inoculación 
Dado que las fermentaciones realizadas en los almacenes no realizadas pero con mostos mostos estériles, a pesar de ser tratados con azufre, tienen una microbiota propia, estudió la aplicación de algunos de los cebadores diseñados cultivos en los mostos naturales no estériles. Esto se utilizó puré de Tempranillo con un recuento inicial de levadura alta (> 106 ufc / ml). 90% de estas cepas no eran Saccharomyces y aunque no había ninguna especie claramente dominantes, H. guilliermondii, H. osmophila y Zygosaccharomyces Cidra, representados, cada uno entre 20 y 30% de la microbiota inicial. Es de destacar que en el mosto no detectó H. manteletes, lo que facilitó el seguimiento mediante técnicas moleculares de la cepa inoculada (Viana et al., 2011a).        
Dado que algunas firmas comerciales recomiendan la aplicación de las culturas mixtas secuencialmente para una mejor aplicación, incluido este tipo de inoculación (primera inoculado en la levadura Saccharomyces y después de varios días inoculados S. cerevisiae) en comparación con el conjunto de la inoculación (levaduras inoculadas ambos a la vez). El tipo de la inoculación no influyó significativamente en la cinética de la fermentación, aunque en la especie predominante. En la inoculación secuencial, H. manteletes 1.471 mil fue la especie de levadura en Saccharomyces vigente en el inicio de la fermentación (1 y 3), que no se observó en el caso de la inoculación conjunta. En consonancia con el aumento del crecimiento de la cepa de H. manteletes en la fermentación secuencial, la concentración de acetato de 2-feniletilo (1,7 mg / L) fue mayor con significación estadística, a la obtenida en los vinos inoculados juntos (0,8 mg / l). Para dar contexto a estas cantidades de acetato de 2-fenetil con cantidades más altas obtenidas en los mostos estériles, recuerde que el porcentaje de mínimo H. manteletes el iniciador para el que alcanza una concentración significativa del éster fue del 50%. Con este porcentaje alcanzado una célula concentración H. manteletes superior a S. cerevisiae durante los tres primeros días de fermentación, que no era posible en el caso de no debe estéril a pesar de utilizar un inóculo 90:10. Es obvio que la presencia de la microbiota nativa en este caso influyó en el crecimiento de H. manteletes por lo tanto no y alcanzó concentraciones tan altas de acetato de 2-fenetilo tal como se obtiene en los mostos estériles. Por último, tenga en cuenta que no se puede descartar la contribución de la microbiota nativa a la concentración final de 2-fenetilo, sobre todo teniendo en cuenta la presencia de H. guilliermondii en el mosto y durante los primeros días de fermentación, ya que es una especie de reconocida capacidad para formar dicho éster.                   
Inmovilización de H. manteletes y su uso en una inoculación mixta secuencial  
Una estrategia eficaz para controlar el período de estancia en la levadura Saccharomyces en el jugo de fermentación es celular inmovilización. Esta estrategia ha sido aplicada con éxito en el caso de Schizosaccharomyces pombe al inicio de la fermentación alcohólica para conseguir un consumo parcial o total de ácido málico y evitar, una vez logrado el efecto, el desarrollo de aromas extraña característica de esta levadura.    
."Una estrategia eficaz para controlar el período de estancia en la levadura Saccharomyces en el jugo de la fermentación es celular inmovilización."  
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En el caso específico de H. manteletes, la inmovilización, y asegure la virtual desaparición de la levadura, que modular la cantidad de acetato de 2-fenetil dependiendo del momento de la retirada. Así que, después de comprobar que el atrapamiento H. manteletes en perlas de alginato no afectó a la capacidad de la formación de acetato de 2-fenetilo, seleccionado tres veces para que la eliminación de células inmovilizadas y la inoculación de S. cerevisiae en forma libre. Considerando que el período de estancia está relacionada con la producción del éster, se seleccionaron los días 4, 5 y 6 de fermentación, que corresponde a un consumo de 25, 50 y 60% de los azúcares iniciales. Después de la inoculación con S. cerevisiae se completó la fermentación, resultando en vinos con todos los parámetros enológicos dentro del margen que se considera apropiado y lo que es más importante, con diferentes concentraciones de acetato de 2-fenetilo 2,7 mg / L cuando se retiró H. manteletes el cuarto día, 4,7 mg / L cuando se retiró el quinto, y 6.4 mg / L para eliminar la levadura inmovilizada después de 6 días de fermentación (Viana et al., 2011b).           
Consideraciones finales
Teniendo en cuenta todas las consideraciones anteriores, es evidente que el uso de cultivos iniciadores mezclados levadura Saccharomyces criterios seleccionados enológicas razonable es una alternativa prometedora que merece la pena seguir explorando.   
Los resultados muestran que H. manteletes 1471, como parte de cultivos iniciadores, produce vinos cuyos parámetros enológicos están en el rango descrito en su caso, y es capaz de aumentar los niveles de acetato de 2-fenetilo en comparación con los producidos por S. cerevisiae. Sin embargo, dada la complejidad aromática del vino, debe ser estudiado en mayor profundidad el impacto del aumento de un solo compuesto en el sabor general. Curiosamente, ya sea mediante la proporción de H. manteletes el iniciador mezclado como a través de la inmovilización es posible modular la concentración de acetato de 2-fenetilo. Ambas estrategias son atractivas para el enólogo y sería esencial para profundizar en su estudio.      
Por último, un aspecto muy importante que no se ha abordado en estos estudios, y facilitar la aplicación de H. manteletes escala industrial, su producción sería en forma de levadura seca activa como los iniciadores de S. cerevisiae. Esperemos que, dada la experiencia de las empresas elaboradas levaduras producen diferentes especies de no-Saccharomyces forma LSA no presenta grandes dificultades, y en los próximos años para aumentar la oferta comercial de este tipo de arranque.     

Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el MINECO través de proyectos y AGL2003-01295 AGL2004-00978. Los autores agradecen a todos sus socios por su contribución a este trabajo.

Bibliografía
Rojo V:. Actividades esterasa en la elaboración del vino de la levadura. Tesis Doctoral, Universidad de Valencia, 2002
Viana F:. Levaduras en Saccharomyces para modular el aroma de la parte del vino: el aumento de etilo y 2-fenetilo utilizando cultivos iniciadores mezclados. Tesis Doctoral, Universidad Politécnica de Valencia, 2011. Viana F. Gil JV, Génova S., S. Valles, Manzanares P:. La selección racional de la no-Saccharomyces levaduras del vino es mezclado entrantes basados ​​en la formación de éster y características enológicas. Microbiología de Alimentos 2008; 25: 778 a 85. Viana F. Gil JV, S. Valles, Manzanares P:. El aumento de los niveles de acetato de 2-feniletilo en el vino a través de la utilización de un cultivo mixto de Hanseniaspora osmophila y Saccharomyces cerevisiae. Revista Internacional de Microbiología de Alimentos 2009; 135: 68-74. F. Viana, Belloch C., S. Valles, Manzanares P:. (2011). Seguimiento del plato mixto de Hanseniaspora manteletes - Saccharomyces cerevisiae en el mosto natural: impacto en la producción de acetato de 2-feniletilo. Revista Internacional de Microbiología de Alimentos de 2011; 151: 235-40. F. Viana, Taillandier P., S. Valles, Strehaiano P., P:. Manzanares 2-feniletilo formación de etilo mediante células inmovilizadas de Hanseniaspora manteletes. En fermentaciones mixtas secuenciales American Journal de Enología y Viticultura 2011b; 62: 122-6. 
 
    
     
    




[08/27/15]

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