29/3/16

Aplicación de técnicas de secuenciación de nueva 
generación para la detección de Brettanomyces y 
otros contaminantes microbiológicos en el vino de
 crianza y durante el embotellado
María del Carmen Portillo y Jessica Lleixa Grupo de Biotecnología Enológica,
Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili (URV),
 Tarragona
http://www.fe.urv.cat/grups-recerca/es_biotecnologia_enologica.html
Las contaminaciones microbiológicas del vino son muy perjudiciales por
las considerables pérdidas económicas que representan para el sector vitivinícola
y porque, si no son detectadas a tiempo, repercuten gravemente sobre la reputación
y economía de la bodega productora. Esta situación
 es aún más grave en el caso de
los vinos de crianza por el valor añadido de los mismos.
.......
. .















Brettanomyces bruxellensis (fig. 1) ha sido caracterizada históricamente como el principal agente responsable de la formación de fenoles volátiles como el 4-etilfenol, 4-etilguaiacol y tetrahidropiridinas, que producen aromas desagradables que alteran el vino sobre todo en las últimas etapas. Aunque no es necesariamente muy abundante, Brettanomyces se ha detectado en la uva y en el equipo de la bodega,1 y prolifera durante la crianza del vino y embotellado donde las poblaciones aumentan de manera lenta pero sin competencia, originando los principales riesgos.
Es destacable señalar que es muy probable que ninguna región vitivinícola esté libre de este microorganismo y que no hace falta un gran número de células de Brettanomyces para desarrollar la alteración, ya que por encima de 1000 células/mL la calidad organoléptica del vino está seriamente comprometida. Sin embargo, la relación presencia de Brettanomyces-deterioro del vino no es siempre evidente. En algunos estudios de nuestro grupo de investigación se han detectado especies alterantes comoBrettanomyces tanto en vinos deteriorados como en vinos sin ninguna alteración aparente.2
Entre los motivos de su proliferación se encuentran:
  • un estado sanitario deficitario de la uva de partida con lo que la concentración de levaduras iniciales sería inaceptablemente elevada;
  • etapas prefermentativas, aunque se realicen a baja temperatura, ya que el crecimiento de B. bruxellensis solo se ve inhibido por debajo de 8ºC;
  • exceso de nutrición durante la fermentación que produzca azucares residuales o aminoácidos y sales amoniacales que la levadura podrá usar para su crecimiento después de la fermentación;
  • una relación inadecuada entre pH y contenido de sulfuroso, puesto que los pH elevados disminuyen la cantidad de SO2 molecular, bajando así su efecto antimicrobiano;
  • una limpieza inadecuada de las barricas;
  • presencia de oxígeno que estimule la producción de acidez volátil.

Detección en bodega
La detección en bodega de Brettanomyces se suele realizar mediante análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa de los vinos en crianza para detectar la presencia de 4 etilfenol/ guayacol. Sin embargo, este método suele ser confirmativo, pues cuando se detecta el compuesto implica que la población de esta levadura es bastante elevada con lo que reparar la alteración resulta muy complicado.
Otros métodos de detección se basan en el empleo de medios de cultivo, como el DBDM,3 con agentes selectivos y diferenciales para evitar el crecimiento de otros microorganismos como levaduras, bacterias lácticas, etc., que poseen tasas de crecimiento mayor. Por otro lado, es necesario tratar volúmenes elevados de vino porque las poblaciones de Brettanomyces que suponen riesgo en vino se han determinado en 10 UFC/mL y el crecimiento lento de esta levadura hace que los tiempos de incubación sean de 8-10 días, posponiendo así la detección del problema.
Además, otro factor que complica su detección en el vino es la presencia de células en estado viable pero no cultivable (VPNC),4 efecto que viene dado por la adaptación de estos microorganismos a condiciones extremas del vino (concentraciones de etanol, polifenoles, SO2, ausencia de oxígeno, etc.). El fenotipo de VPNC se caracteriza por la incapacidad de las células de crecer en medio de cultivo aunque mantengan su actividad metabólica o celular de forma que pueden volver a ser cultivables cuando las condiciones ambientales sean favorables. Este fenómeno podría inducir a falsos negativos o infravaloración en placa de vinos con una considerable concentración de la levadura en este estado fisiológico, lo que supondría un riesgo para el vino analizado.2,4

Ventajas de las nuevas técnicas moleculares
Recientemente, la utilización de técnicas moleculares basadas en el material genético supone una ventaja respecto a las técnicas clásicas basadas en el cultivo. Las técnicas moleculares utilizadas incluyen análisis como la restricción del DNA mitocondrial,5 PCR-RFLP,6,7 PCR-RAPD,5 PCR con cebadores específicos8 y PCR anidada.9
Sin embargo, muchas de estas técnicas necesitan un paso de enriquecimiento previo para extraer el DNA de forma que son técnicas semicuantitativas. Por ello, se está tendiendo al uso de qPCR para la detección específica y cuantificación de B. bruxellensis directamente del vino. Aunque estas técnicas reducen el tiempo de análisis con respecto a las técnicas de cultivo y detectan incluso las células VPNC, al usar el DNA se detectan tanto células vivas como muertas, pudiendo dar lugar a una sobreestimación del número de levaduras en la muestra.2
Gracias a la introducción del bromuro monoazódico de etidio (EMA) o bromuro moazódico de propidio (PMB) combinados con la qPCR se han podido detectar únicamente las células vivas.2 Sin embargo, es necesario optimizar la concentración de EMA para ensayos diferentes y la concentración de etanol afecta los resultados.2
 El RNA es considerado como un buen indicador de viabilidad ya que se degrada más rápidamente que el DNA10 aunque también es dependiente del gen usado para la detección. El problema principal de la qPCR a partir tanto de DNA como de RNA es que la qPCR solo detecta y cuantifica los microorganismos diana para los cuales hayamos diseñado cebadores de amplificación específicos y se desconoce si dichos microorganismos son los únicos implicados en el deterioro del vino.
En la actualidad, el estudio de la diversidad microbiana puede realizarse mediante una nueva técnica molecular denominada secuenciación masiva o HTS (de sus siglas en inglés high throughput sequencing).Consiste en la secuenciación de miles de secuencias por cada muestra tras la extracción directa de ácidos nucleicos de la matriz que se esté estudiando, en nuestro caso el vino. Existen diferentes tecnologías de secuenciación masiva11 cada una con sus ventajas y desventajas.12,13
El estudio de la composición microbiana se realiza de forma habitual mediante la amplificación de genes de interés taxonómico (normalmente el gen rRNA 16S para bacterias y el gen de rRNA 18S o el ITS para hongos) y puede ofrecer la proporción de los distintos grupos taxonómicos dentro de un alimento mediante la secuenciación de estos genes y su comparación con las bases de datos de referencia que proporcionarán la identificación de las distintas secuencias con lo que, además, tiene carácter cuantitativo.
En los últimos años, la secuenciación masiva se ha aplicado en prácticamente todos los campos de investigación de microbiología incluidos estudios sobre alimentos aunque el coste de estos análisis y el requerimiento de habilidades específicas bioinformáticas aún limitan su aplicación industrial.
Muchos de estos estudios tenían un marcado carácter de ecología microbiana (revisado en Ercolini).14 Por ejemplo, en el ámbito del vino se ha utilizado esta técnica para describir el microbioma del viñedo15-19 y las bodegas e instalaciones.15 Zarraonaindia et al.18 demuestran que la microbiota de la vid viene influenciada por las bacterias del suelo en el que se encuentran, las cuales son una importante fuente para las bacterias encontradas en la planta y uva. En esta misma línea, Portillo et al.19 demuestran que no solo la variedad de uva y el viñedo influyen en la microbiota residente en los racimos, sino que, además, factores como la orientación geográfica del viñedo marcan las diferencias en la composición bacteriana de las uvas dentro de la denominación de origen del Priorat (fig. 2).

Figura 2. Gráfica de escalado multidimensional (EMD) de las distancias Unifrac (matrices de distancia entre muestras generadas tanto con la composición taxonómica de cada muestra como con la abundancia de cada OTU) entre las muestras de mostos de garnacha y cariñena pertenecientes a cinco viñedos del Priorat, FB: Ferrer Bobet; MM: Mas Martinet; JS: Jaume Sabaté; RD: Roca las Dotze; MB: Mas Botó. (A) Agrupamiento de las comunidades bacterianas según la variedad con las réplicas de muestras incluidas en círculos negros (RANOSIM= 0,191; P=0,005). (B) Agrupamiento de las muestras de mostos de garnacha y cariñena según la orientación geográfica de los viñedos (RANOSIM= 0,84; P=0,001).

Brettanomyces no ha sido detectada entre las cientos de especies descritas como componentes del microbioma de la vid, mientras que Saccharomyces cerevisiae sí fue detectada, aunque poco
Por lo tanto, la identificación de los nichos naturales donde B. bruxellensis se encuentra es uno de los retos que limitan nuestro entendimiento sobre su biología y cómo se ha dispersado globalmente. Podríamos esperar que con el descenso en los costes de secuenciación próximamente se pueda revelar la presencia de esta especie fuera del ambiente de las bodegas.

Hacia un mapa mundial de perfiles microbiológicos en regiones vitivinícolas
Un ejemplo de aplicación de HTS en el mundo comercial lo constituye Biome Makers, una empresa fundada por españoles con sede en San Francisco que ha apostado por introducir las técnicas genómicas en el mundo del vino. Actualmente ofrecen el estudio de suelo de viñedos que permite crear un mapa mundial de los perfiles microbiológicos en las diferentes regionales de vino y ver su evolución a lo largo de los años, con el objetivo de descifrar la influencia del suelo tanto en el proceso de vinificación como en el tipo de variedad de uva.

Esta empresa ha sido seleccionada por el primer programa de aceleración de empresas biotecnológicas en el área de la genética existente a escala mundial, promovido por la multinacional Ilumina (empresa líder en tecnología de secuenciación masiva).
Con la filosofía según la cual, «el microbioma da una identidad única al terruño», WineSEQ propone identificar comunidades microbiológicas en diferentes regiones vitivinícolas del mundo, que permitan comparar entre distintas localizaciones para mejorar la calidad del vino.
Más información en www.wineseq.net/

Las técnicas de HTS también se han aplicado ampliamente al estudio de la fermentación de alimentos o su deterioro microbiano14 y, recientemente, se ha puesto de manifiesto la capacidad y potencial de estas técnicas de HTS para poder detectar contaminaciones en alimentos y su posible trazabilidad en el entorno en el cual se procesan dichos alimentos.20 Hay que recordar que en muchos alimentos existen microorganismos pertenecientes al mismo género y en estos casos los estudios de HTS basados en secuencias muy cortas a nivel de género no serían de utilidad para diferenciar entre dichas especies. En estos casos, para obtener información a nivel de especie habría que tener como diana fragmentos más largos incluyendo más regiones variables de los genes taxonómicos o bien, complementar la técnica de HTS con alguna técnica de tipificación de especies como la RFLP (por ejemplo, Bokulich et al.21).
La ventaja indudable que las técnicas HTS aportarían al estudio del deterioro en el vino es que, al obtener miles de secuencias para una única muestra, se puede tener una descripción detallada de todos los microorganismos presentes en el deterioro y el cambio poblacional previo a la proliferación de un determinado microorganismo responsable de la alteración, con lo que podría tener carácter predictivo.
Además, las técnicas HTS pueden procesar cientos de muestras simultáneamente y se pueden realizar tanto a partir de DNA como de RNA, con lo que se podría tener información tanto de los microorganismos presentes, como los metabólicamente activos en el momento del deterioro, respectivamente. Por otro lado, mediante la metatranscriptómica (secuenciación masiva de todos los genes que se están transcribiendo en un determinado momento) se podría tener información de las interacciones metabólicas entre los distintos microorganismos implicados en el deterioro del vino. Todas estas técnicas basadas en secuenciación masiva, sin duda ofrecen una oportunidad para un estudio más detallado de los microbios responsables de la fermentación del vino y en su caso, de su posible deterioro.
Aunque las técnicas HTS no sean aplicables a corto plazo por las bodegas como rutina debido a los elevados costes de inversión en la tecnología necesaria y el grado de conocimiento específico que se necesita para realizar dicho análisis e interpretación de datos, sí que se pueden desarrollar servicios a bodegas, en la línea de la compañía Biome Makers ya citada, para que realicen análisis periódicos de poblaciones en vinos de crianza y así poder prevenir posibles contaminaciones microbianas.

Bibliografía
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18. Zarraonaindia I., Owens S.M., Weisenhorn P., West K., Hampton-Marcell J., Lax S., Bokulich N., Mills D.A., Martin G., Taghavi S., Van der Lelie D., Gilbert J.A.: The soil microbiome influences grapevine-associated microbiota. MBio 2015; 6: e02527-14.
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21. Bokulich N. A., Joseph C. M. L., Allen G., Benson A. K., Mills D. A.: Next-Generation Sequencing Reveals Significant Bacterial Diversity of Botrytized Wine. PLoS ONE 2012; 7: e36357. doi:10.1371/journal.pone.0036357.

Bibliografía general

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Claesson M.J., Wang Q., O’Sullivan O., Greene-Diniz R., Cole J.R., Ross R.P., O’Toole P.W.: Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 2010; 38: e200. doi:10 .1093/nar/gkq873.
Fuller C.W., Middendorf L.R., Benner S.A., Church G.M., Harris T., Huang X., Jovanovich S.B., Nelson J.R., Schloss J.A., Schwartz D.C., Vezenov D.V.: The challenges of sequencing by synthesis. Nat Biotechnol 2009; 27: 1013-23.
Glenn T.C.: Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour 2011; 11: 759-69.
Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B., Lonvaud-Funel A.: Handbook of Enology. The Microbiology of Wine and Vinifications. Vol 1. 2nd ed. West Sussex, England: John Wiley & Sons Ltd., 2016.

24/3/16

Base química y sensorial de la astringencia y del sabor amargo.


Purificación Fernández-Zurbano,1 María-Pilar Sáenz-Navajas,2 José Miguel Avizcuri,1,2
Ana Gonzalo,1 Marivel González,1 Marta Dizy,1 Vicente Ferreira2 y Juan Cacho2 1 Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (Universidad de La Rioja-CSIC-CAR).
Finca La Grajera. Logroño (La Rioja), España
2 Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología (LAAE), Departamento de química analítica.

Universidad de Zaragoza. Instituto agroalimentario de Aragón (IA2). Unidad Asociada al
Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (ICVV). Zaragoza, España
La calidad del vino se considera una variable compleja y multidimensional que está
formada tanto por dimensiones intrínsecas como por dimensiones extrínsecas.1
Las dimensiones extrínsecas son propiedades que no son físicamente parte del vino,
como región, añada, diseño de la etiqueta, enólogo, peso de la botella, presencia/ausencia
de premios, etc., mientras que las dimensionesintrínsecas son las relacionadas con el vino
en sí y no pueden modificarse una vez que se embotella el producto. Estas últimas están
vinculadas a propiedades organolépticas tales como el aroma, sabor, color o sensación en
la boca.2,3 Teniendo en cuenta que, en la actualidad, el vino desempeña principalmente
un papel hedónico, la calidad está muy relacionada con sus propiedades organolépticas y,
por tanto, con las propiedades intrínsecas ligadas a la experiencia global del flavor percibido
durante su consumo.4 La percepción del flavor es el resultado de la combinación de todas
las sensaciones percibidas en las cavidades bucal y nasal, incluyendo aroma, sabor y
sensaciones táctiles.
En los últimos años, la bibliografía elaborada en torno al vino revela la importancia que
los investigadores dan al conocimiento de las características sensoriales de los vinos. Una
gran mayoría de los trabajos se refiere a la implicación de los compuestos volátiles en el
roma mientras que, en lo referente a las moléculas no volátiles y el gusto, la bibliografía
es más limitada. A pesar de la importancia de conocer la implicación real de la composición
no volátil en el flavor del vino, en la actualidad esta cuestión no está resuelta, si bien su
importancia se ha puesto de manifiesto en repetidas ocasiones en la bibliografía. Así,
Breslin5 señala que los compuestos no volátiles, principalmente responsables del sabor y
de las sensaciones táctiles, crean la base psicológica-sensorial del flavor sobre la que se
construye el aroma y de ahí la importancia que tiene el conocimiento no solo de la
composición volátil, sino también del sabor y las sensaciones táctiles para llegar a comprender
el flavor. Por lo tanto, cabe preguntarse cuál es el peso de las características organolépticas
percibidas por la vista, nariz y boca en el concepto de calidad que construyen los expertos al
degustar un vino. Si la percepción en boca está implicada en el concepto de calidad de los expertos la siguiente cuestión es preguntarse cuáles son las características en boca más importantes en la calidad percibida por los expertos. Para tratar de contestar a la primera cuestión se diseñó un trabajo con un panel sensorial en el que los jueces debían evaluar la calidad de 17 vinos tintos en 4 condiciones distintas:
1) en base solo a la percepción del aroma ortonosal (en nariz y con copa negra);
2) en base solo a la percepción en boca (copa negra, nariz tapada);
3) en base solo a la percepción visual (sin oler y sin probar el vino y copa transparente) y
4) evaluación global de la calidad (en copa transparente y oliendo y probando el vino) (fig. 1).

Figura 1. Evaluación de la calidad en base a 1) aroma ortonasal, 2) percepción en boca (con piza en la nariz), 3) percepción visual (sin oler y sin probar el vino y copa transparente) y 4) evaluación global de la calidad (en copa transparente y oliendo y probando el vino)
El resultado de este trabajo muestra que las tres fases (visual, aroma y sabor) que los expertos emplean en la evaluación sensorial del vino están significativamente correlacionadas con la evaluación global de la calidad. Sin embargo, existen diferencias ya que el mayor coeficiente de correlación se encuentra entre la calidad global y la calidad evaluada en base al aroma ortonasal y el menor coeficiente de correlación corresponde a la relación entre la calidad global y la calidad evaluada en boca. No obstante, para la predicción global de la calidad es necesaria la información obtenida en las tres fases incluida la percepción en boca6 (fig. 2).
Figura 2. La calidad global percibida por los expertos es predicha a partir de las tres evaluaciones de calidad hechas (calidad del aroma ortonasal, calidad en boca, y calidad visual)

En esta línea, y en relación con las características en boca, muy habitualmente se utiliza la expresión «estructura del vino». Si esta es adecuada se incrementará la calidad percibida, en el caso contrario muy probablemente la evaluación de la calidad será baja. No hay una definición única para la estructura del vino, pero podemos aceptar que una buena estructura en boca significa que los sabores y las sensaciones en boca aparecen a la vez potentes y equilibrados.
En relación con los distintos atributos evaluados en boca podemos decir que se han encontrado diferentes resultados en función del segmento de precio de los vinos evaluados. Así estudiados tres grupos de vinos que corresponde cada uno con un segmento de precio distinto (gama alta entre 15-20 €; gama media entre 6-14 € y gama baja entre 1-5 €) se encontró que en los tres casos la calidad estuvo correlacionada con la persistencia y la intensidad global en boca. En los vinos de mayor precio la calidad se mostró además correlacionada con la acidez y la astringencia, mientras que en los vinos de precio medio la calidad estuvo correlacionada con la acidez, pero no con la astringencia. En los vinos de precio bajo la calidad no estuvo correlacionada ni con la acidez, ni con la astringencia ni con el amargor.7 En los dos primeros grupos de vinos los panelistas no fueron consistentes en su evaluación del amargor.

Bases químicas de la astringencia en el vino
Modelos predictivos de la astringencia
La astringencia es definida como una sensación táctil percibida en la cavidad bucal que ha sido descrita con distintas subpropiedades.8,9 Gawel et al.8 presentaron un vocabulario estructurado elaborado por un panel de catadores experimentados para describir las subcualidades de la astringencia incluyendo términos como «aterciopelada», «secante» o «rugosa». Entre los compuestos químicos presentes en el vino es la composición no volátil, principalmente la composición polifenólica, la que siempre se ha relacionado con la sensación de astringencia. Resulta, por lo tanto, muy importante para la industria vitivinícola determinar la implicación de estos compuestos en la astringencia de los vinos. Con el fin de encontrar qué compuestos no volátiles están implicados en la sensación de astringencia y determinar la capacidad predictiva de estos compuestos en la astringencia, los tres grupos de vinos de distintos segmentos de precios anteriormente citados fueron analizados química y sensorialmente.7,10,11
De todos los compuestos analizados se seleccionaron aquellos que podían tener una implicación en la astringencia. Esta selección se realizó en base a tres criterios:
· 1) La relación entre la concentración de un compuesto y la concentración umbral de ese compuesto (DoT) debe ser mayor de 1,
· 2) la relación entre la concentración máxima y la mínima debe ser mayor de 2 en, al menos, uno de los vinos del grupo y/o
· 3) correlación de Pearson significativa entre la puntuación dada para la astringencia en cada grupo de vinos y la concentración del compuesto.
Estos criterios permitieron hacer una selección de compuestos con posible implicación sensorial en la astringencia y construir un modelo predictivo mediante regresión de mínimos cuadrados para cada grupo de vinos. Los modelos obtenidos se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: Modelos matemáticos predictivos obtenidos para la astringencia a partir de la composición química no volátil de tres grupos de vinos pertenecientes a distintos segmentos de precio
Vinos gama alta
Astringencia = 0,269*Etanol + 0,203*Azúcares_Reductores + 0,185*PAs poliméricas + 0,167*t-Aconítico + 0,179*Coutárico + 0,184*Quercetina-Galactósido
Vinos gama media
Astringencia = - 0,016 + 0,37*Etanol + 0,29*Procatéquico + 0,23*Coutárico+ 0,50*PAs poliméricas + 0,07*c-Aconítico + 0,05*Caftárico
Vinos gama baja
Astringencia = 1,316 + 0,0037 Ácido gálico + 0,013 Procianidina B1 + 0,0004 Catequina – 0,0038 Procianidina B2 – 0,010 Epicatequina + 2,518 LPP + 0.144 PPA + 0,005 PA poliméricas


En los tres modelos obtenidos el peso de los parámetros relacionados con las proantocianidinas (PA) es alto lo que permite afirmar que estos compuestos tienen un peso importante en la predicción de la astringencia de los tres grupos de vinos. En relación con el resto de la composición no volátil, los modelos de los vinos de gama alta y gama media son más parecidos entre sí ya que en ambos son retenidos el ácido aconítico, ácidos hidroxicinámicos (cutárico y caftárico) y el contenido en alcohol. Las diferencias más importantes entre ambos modelos son los azúcares reductores y un flavanol retenidos en el modelo de los vinos de gama alta y el ácido protocatéquico en el modelo de los vinos de gama media. En el caso de los vinos de gama baja, los compuestos polifenólicos de bajo peso molecular retenidos son claramente diferentes a los otros modelos.
Validación de los modelos obtenidos
Una cuestión importante que aporte información enológica de interés a los modelos matemáticos obtenidos es validar la implicación sensorial de los compuestos retenidos en los modelos. Para ello se ha realizado la adición de los compuestos con capacidad predictiva a un vino neutro, es decir, un vino comercial sin defectos y sin destacados atributos sensoriales en boca ni en nariz. Este vino fue analizado en los compuestos de interés antes y después del correspondiente dopaje. Una vez realizado el dopaje del vino con el compuesto objeto de estudio se procedió a una evaluación sensorial en boca empleando un test triangular.11 En la tabla 2 se muestran las 24 pruebas de adición o fortificación que se realizaron tanto en vino neutro, como en disoluciones acuosas.

Tabla 2: Tests triangulares para validar el efecto de la adición de compuestos con capacidad predictiva en la astringencia[Clique aquí para ampliar en pdf]
a Relación de concentración de los acidos trans- / cis- aconítico.
b Significatividad del efecto; ns: no significativo. Efecto significativo marcado en negrita.
c Expresado en g L-1 of PA medidos por el índice de la vanillina.
d Expresado en g L-1.

En las pruebas 1 y 2 (de la tabla 2), la fracción de proantocianidinas o taninos aislada a partir de un vino muy astringente se añadió al vino tinto neutro. La adición de dicha fracción induce diferencias sensoriales significativas en la matriz del vino neutro. La muestra fortificada fue descrita como más astringente por el 100% de los panelistas en la prueba 1, en la que la adición de PA o taninos se llevó a cabo a concentraciones reales presentes en los vinos. En la prueba 2, el vino neutro fue fortificado con la fracción de PA diluida 1:10. El análisis sensorial mostró que, en esta prueba 2, la muestra fortificada fue identificada no solo como más astringente (50% de las respuestas) sino también como más ácida (60% de las respuestas). Estos resultados confirman la destacada relevancia sensorial de este grupo de compuestos en las propiedades sensoriales de astringencia y sabor de los vinos tintos. El resto de los resultados obtenidos en las pruebas de adición o fortificación fueron sorprendentes y revelaron la existencia de interacciones perceptivas extremadamente complejas entre los diferentes compuestos no volátiles sensorialmente activos. Cabe destacar, que la adición de ácido c-aconítico tanto en vino como en agua (pruebas 4 y 5, tabla 2) no pudo ser detectada por nuestro panel, lo que está en claro contraste con los resultados obtenidos en otros trabajos10,12,13 y también está en aparente contradicción con el papel que este compuesto parece desempeñar en la astringencia atendiendo al modelo de los vinos de gama alta. Del mismo modo, la adición de ácido t-caftárico al vino (prueba 13, tabla 2), no pudo ser detectada, por lo tanto no se confirma la implicación que ambos modelos atribuyen a este compuesto. El éster etílico del ácido protocatéquico y el ácido cutárico, también presentes en los modelos de astringencia, no pudieron ser verificados debido a la falta de la cantidad necesaria de estándar o patrón para llevar a cabo las pruebas sensoriales. La complejidad del problema se muestra perfectamente con los experimentos sensoriales realizados con los ácidos t-c-aconítico (pruebas 4 a 10, tabla 2), con las llevadas a cabo también con los ácidos cafeico y caftárico (pruebas 11 a 15, tabla 2) y con las que se realizaron con diferentes flavonoles (pruebas 18 a 24, tabla 2). Mientras el ácido t-aconítico pudo ser detectado significativamente a los niveles máximos que se encuentran en el conjunto de muestras (pruebas 6 y 7, tabla 2), esto no ocurrió en el caso del c-aconítico. Inicialmente, se hipotetizó que ambos isómeros ejercerían un efecto aditivo, por lo que la adición simultánea de ambos compuestos sería fácilmente detectada por el panel sensorial. Por el contrario, lo que se ha observado repetidamente, ya que todos estos experimentos fueron replicados, es que la adición de la mezcla de dos isómeros tanto a vino (prueba 8, tabla 2) como a agua (prueba 9, tabla 2) no pudieron ser detectados.
Esta falta de aditividad en las respuestas sensoriales provocadas por compuestos de la misma familia fue observada también en el caso de los ácidos hidroxicinámicos y de los flavonoles. Los resultados fueron, sin embargo, bastante diferentes cuando la adición de los ácidos se llevó a cabo junto con un compuesto de carácter dulce. La presencia de una cantidad no detectable de sacarosa (prueba 3, tabla 2) en una mezcla de ácidos c-t-aconítico (prueba 10, tabla 2) o de los ácidos t-aconítico y t-cafeico (prueba 15, tabla 2) produjo un aumento significativo (a un nivel del 95%) en el número de panelistas (16 de los 36 panelistas) que fueron capaces de diferenciar entre el vino y la muestra fortificada en comparación con las pruebas 8 o 14, en las que solo los ácidos estaban presentes en la muestra fortificada. Mientras que todos estos resultados ciertamente parecen confirmar la pobre aditividad de las señales sensoriales relacionadas con la astringencia, también revelan la posible existencia de interacciones entre las distintas sensaciones (dulzor x astringencia).
Interacción de otros atributos sensoriales en la astringencia
Con el objetivo de evaluar la posible implicación de otros atributos sensoriales en la percepción de la astringencia, se procedió de forma similar a lo descrito para la obtención del modelo matemático de la astringencia construido a partir de la composición química de los 36 vinos estudiados. Por lo tanto, a partir de los atributos sensoriales descritos en estos vinos por el panel sensorial se construyó un modelo predictivo mediante regresión de mínimos cuadrados con validación cruzada completa. Tres atributos en boca; «amargor», «intensidad global», «persistencia» y un término aromático «especias» fueron retenidos en el modelo. En la regresión, la segunda componente explicó el 64% de la varianza total (62% de la varianza cruzada) con un RMSE de 0,44. El modelo matemático calculado fue el siguiente:

Astringencia = - 6,371 + 0,583 Amargor + 0,619 Persistencia + 0,029 Especias + 0,857 Intensidad global

En este modelo de predicción, se observó una contribución positiva de los cuatro atributos sensoriales considerados. La «intensidad global» fue la variable que presentó un mayor peso en el modelo seguido de la «persistencia». Es importante destacar que el término combinado «especias» estuvo formado por siete términos individuales tales como «especias», «regaliz», «vainilla», «mentol/fresco», «pimienta», «clavo» y «nuez moscada».14
Por último, se construyó un modelo predictivo a partir de siete compuestos químicos y cuatro atributos sensoriales. La segunda componente explicó el 77% de la varianza total (71% de la varianza cruzada) con un RMSE de 0,35. El modelo obtenido fue:

Astringencia = - 4,818 + 0,002 Ácido gálico + 0,529 Amargor + 0,0035 Procianidina B1 + 0,01 Especias - 0,0004 Catequina - 0,0023 Procianidina B2 - 0,009 Epicatequina + 1,125 LPP + 0,094 PA polisacáridas complejas + 0,0027 PA poliméricas + 0,482 Persistencia

El modelo recoge once variables significativas, de las cuales todas las variables contribuyen positivamente a la astringencia percibida a excepción de la catequina, la epicatequina y la procianidina B2 que contribuye negativamente. Los pigmentos poliméricos grandes fue la variable de mayor peso en el modelo seguido del atributo «amargor».

Bases químicas del sabor amargo en el vino
Modelos predictivos del sabor amargor
Entre los atributos evaluados en boca y que contribuyen a la estructura de los vinos el amargor es, a día de hoy, el sabor sobre el que menor conocimiento existe acerca de los compuestos químicos responsables del mismo y, de hecho, en la bibliografía se encuentran resultados controvertidos en relación con los compuestos implicados en el mismo.15-17 En general, se apunta a los compuestos polifenólicos como compuestos responsables del sabor amargo, en concreto los compuestos polifenólicos de bajo peso molecular, así como las proantocianidinas más pequeñas (dímeras y trímeros). Sin embargo, muchos de estos compuestos están presentes en los vinos por debajo del umbral sensorial del sabor amargo, aunque Hufnagel y Hofmann17 apuntan que, a pesar de esto, compuestos como los ésteres etílicos de los ácidos fenólicos y flavanoles contribuyen al sabor amargo de los vinos tintos. Además, de la posible contribución al amargor de los vinos de compuestos presentes en concentraciones por debajo de su valor umbral existen otras dificultades en el estudio de este sabor como que los paneles entrenados no son consistentes en el sabor amargo o que los vinos no presentan suficientes diferencias en este atributo.
Con el fin de evaluar la implicación de los compuestos citados en el amargor se trabajó con un panel de dieciocho catadores seleccionados por su capacidad para detectar el sabor amargo, de acuerdo al test de Tepper.18 Seguidamente se evaluaron sensorialmente 36 vinos tintos jóvenes a partir de los cuales se seleccionaron seis vinos en base a sus diferencias significativas en el amargor percibido por los panelistas. Estos seis vinos fueron desaromatizados y fraccionados por cromatografía preparativa de permeación en gel de acuerdo al método descrito por Gonzalo-Diago et al.19 Este fraccionamiento generó dos fracciones F-1 y F-2 (evaluadas sensorialmente por el panel entrenado), mientras la primera fue evaluada como amarga, la segunda fue evaluada con menos de 1 (sobre 9) en este sabor. Posteriormente, la fracción F-1 fue subfraccionada mediante extracción en fase sólida,19 separando por un lado los azúcares y los ácidos orgánicos y, por otra, los compuestos fenólicos de bajo peso molecular. Estas subfracciones se denominarán F-11 y F-12. Ambas fracciones fueron liofilizadas y redisueltas en agua mineral a un factor de concentración respecto al vino de partida de 1:4 para su posterior evaluación sensorial. Los resultados de la evaluación sensorial se muestran en la figura 3. La única subfracción evaluada amarga fue F-12, esta subfracción fue analizada químicamente y los resultados correlacionados con los datos sensoriales del amargor.
Figura 3: Evaluación en boca de 6 vinos y sus correspondientes 6 fracciones y: A) vinos, B) fracción F-1, C) fracción F-12 (amarga)

Los resultados mostraron que el amargor evaluado en los vinos no estaba correlacionado con el amargor evaluado ni en la fracción F-1, ni en la subfracción F-12. Sin embargo, los compuestos analizados en la fracción (polifenoles de bajo peso molecular y PA menores de tres unidades) mostraron capacidad predictiva del amargor evaluado en la subfracción F-12. En la bibliografía tanto en trabajos realizados con disoluciones de un solo compuesto20 como con vinos21,22 se apunta la implicación de otros atributos sensoriales en el sabor amargo.
Interacción de otros atributos sensoriales en el amargor
Los resultados obtenidos de la evaluación sensorial de la fracción amarga muestran que el amargor evaluado en esta fracción no permite explicar el amargor percibido en los vinos iniciales, por lo que otros atributos sensoriales podrían estar implicados en la percepción de dicho sabor. Para profundizar en esta cuestión se realizó el análisis sensorial (nariz y boca) y químico de 36 vinos tintos jóvenes. En primer lugar se realizaron las correlaciones entre el amargor de los vinos con los compuestos químicos analizados. Los resultados muestran que el sabor amargo está correlacionado significativamente con la procianidinas B1 y A2, ácidos trans-caftárico y gálico, catequina, epicatequina, la quercetina-3-O-glucósido, la miricetina y los pigmentos de mediano y gran tamaño (MP). El modelo predictivo obtenido explica el 69% de la varianza (61% por varianza cruzada) con una raíz del error cuadrático medio (RMSE) de 0,164:
AMARGOR = 14.082 + 0.278 Procianidina B1 - 0.446 Ácido trans-caftárico + 0.177 Quercetina-3-O-glucósido + 0.380 Miricetina + 0.261 MP
(Modelo 2)
AMARGOR = 14,082 + 0,278 Procianidina B1 - 0,446 Ácido trans-caftárico + 0,177 Quercetina-3-O-glucósido + 0,380 Miricetina + 0,261 MP

En segundo lugar se realizaron las correlaciones entre el amargor de los vinos y el resto de atributos sensoriales (aroma y boca). Como primera aproximación seis variables sensoriales «acidez», «astringencia», «persistencia», «fruta pasa», «animal» y «vegetal» fueron utilizadas como variables predictivas por presentar una correlación significativa con el sabor amargo. El modelo matemático realizado con dichos atributos retuvo los atributos «vegetal», «acidez» y «astringencia». Este modelo predictivo explica el 80% de la varianza original (76% por varianza cruzada) con un raíz del error cuadrático medio (RMSE) de 0,149:

AMARGOR = 5,019 + 0,369 Vegetal + 0,162 Acidez + 0,678 Astringencia


Con el objetivo de evaluar la capacidad predictiva de los compuestos no volátiles y atributos sensoriales, se construyó un modelo predictivo mediante una regresión de mínimos cuadrados con validación cruzada completa. El tercer modelo obtenido es:

AMARGOR = 5,957 + 0,189 Procianidina B1 - 0,206 Ácido trans-caftárico + 0,083 Quercetina-3-O-glucósido + 0,277 Miricetina + 0,150 MP + 0,299 Acidez + 0,288 Astringencia

Este modelo muestra siete variables significativas: «astringencia», «acidez», procianidina B1, quercetina-3-O-glucósido, miricetina, MP y el ácido trans-caftárico. Todas las variables contribuyeron positivamente al sabor amargor a excepción del ácido trans-caftárico que contribuye negativamente. Siendo, los dos atributos en boca «acidez» y «astringencia» las variables que presentaron un mayor peso en el modelo, seguidas de la miricetina.
Es importante resaltar que la capacidad predictiva del amargor a partir de la composición no volátil es menor que la obtenida a partir de los atributos sensoriales en el sabor amargo. De hecho, la capacidad predictiva del sabor amargo a partir de atributos sensoriales y la composición no volátiles mejora las varianzas explicadas en los modelos obtenidos por separado.

Bibliografía
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22. Sáenz-Navajas M.P., Avizcuri J.M., Ferreira V., Fernández-Zurbano M.P.: Sensory changes during bottle storage of Spanish red wines under different initial oxygen doses. Food Research International2014; 66: 235-46.

21/3/16

Detección y control contaminación microbiológica

Nuevas herramientas moleculares para la detección y control de la contaminación microbiológica durante la elaboración y almacenado de vinos
Maria del Carmen Portillo Grupo de Biotecnología Enológica
Facultad de Enología, Universitat Rovira i Virgili (URV), Tarragona
http://www.fe.urv.cat/grups-recerca/es_biotecnologia_enologica.html
El sector vinícola necesita técnicas rápidas y prácticas para la monitorización y detección de microorganismos que causan el deterioro del vino en cualquiera de sus etapas de fabricación y almacenado para evitar las consecuentes pérdidas económicas. Tanto levaduras como bacterias pueden ser responsables de la contaminación vino y su fuente primordial de contaminación suele ser el propio ambiente de la bodega.
A pesar de que, en muchas ocasiones, se ha podido establecer una relación directa entre especies alterantes y alteraciones específicas del vino, esta no ha sido siempre la situación real, dándose deterioro del vino con poblaciones muy bajas de especies deteriorantes conocidas hasta el momento (e incluso en casos en los que no se detectan).
Asimismo, no se conocen con precisión las razones por las que una determinada población alterante se desarrolla en un momento determinado en una tina de fermentación o barrica, mientras que en otras del mismo origen y con las mismas condiciones no manifiesta dicha población. Entre las razones plausibles se podría considerar que las comunidades microbianas en cada tina o barrica han evolucionado de forma diferente y la interacción con otros microorganismos podría favorecer el desarrollo de las poblaciones alterantes. Este hecho dificulta la predicción de la posible contaminación y su control.
.«Las técnicas moleculares basadas en el material genético son más sensibles a la hora de detectar cierto microorganismo.»
«
Tradicionalmente, la detección de los microorganismos que alteran el vino se ha realizado mediante técnicas dependientes de cultivo. Sin embargo, recientemente, la utilización de técnicas moleculares basadas en el material genético supone una ventaja respecto a las técnicas clásicas basadas en el cultivo, pues no es necesario el cultivo para la detección y son más sensibles a la hora de detectar cierto microorganismo.
En el presente monográfico dedicado a la contaminación microbiana, analizaremos durante el próximo trimestre las distintas etapas de elaboración del vino susceptibles de dicha contaminación, los principales microorganismos implicados y las técnicas de detección de contaminantes microbianos más utilizadas tanto en bodegas como en ámbito de investigación público. Asimismo, se analizará la posibilidad del empleo de técnicas de secuenciación de nueva generación o secuenciación masiva como herramientas para la monitorización de microorganismos contaminantes y sus posibles fuentes de origen.
Recogeremos la opinión del Dr. José Manuel Guillamón frente a los principales contaminantes microbianos durante la fermentación alcohólica. El Dr. Sergi Ferrer desarrollará por su parte los principales problemas de contaminación asociados a la fermentación maloláctica y el estado del arte actual en la detección y prevención de dicha contaminación.
Otro de los trabajos incluidos en este dossier es el elaborado por nuestro grupo, Biotecnología Enológica de la Universidad Rovira i Virgili (Carmen Portillo y Jessica Lleixa). En él nos hemos centrado en hacer una revisión de las contaminaciones en fases de crianza y embotellado del vino y la posible aplicación de las técnicas de secuenciación masiva para la detección de los contaminantes en todas las etapas de elaboración del vino, con una visión general del estado de dichas técnicas en el ámbito de la microbiología de los alimentos. Tendremos también una entrevista con el Dr. Albert Mas, quien es un experto en los microorganismos presentes en el vino y en el desarrollo de técnicas moleculares para su detección y nos aportará su opinión frente al problema de contaminación microbiológica en el vino y cuál es la tendencia de futuro en este tema.

15/3/16

Utilización de inóculos mixtos de levaduras autóctonas como herramienta para reproducir la huella microbiológica de la zona


Albert Mas, Beatriz Padilla, Braulio Esteve-Zarzoso y Gemma BeltranGrupo de Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnología,
Facultad de Enología de Tarragona, Universitat Rovira i Virgili
El uso de levaduras no Saccharomyces es una tendencia cada vez más actual en la elaboración de vinos. Las razones de su utilización son diversas, como por ejemplo, la mejora de la calidad aromática de los vinos, mayor complejidad, mayor producción de glicerol o disminución de etanol. Además, dichas levaduras han merecido la atención de otros artículos de esta serie, derivados del congreso de la ACE celebrado recientemente. El proyecto europeo WILDWINE (EU-FP7-SME-2012), próximo a su finalización, utiliza estas especies de levaduras en otra dirección: la defensa de la tipicidad de la zona (Mas et al. 2014). Cada vez tenemos más evidencias de que cada zona tiene una población de microorganismos característica, lo que se podría denominar su propia “huella dactilar” (en inglés fingerprint) microbiológica (Bokulich et al. 2013). Dicha población se caracteriza por una composición de unos microorganismos mayoritarios y otros minoritarios, que varían en el tiempo y que tienen una dinámica propia según diferentes aspectos relacionados con el manejo del viñedo y la climatología, entre los más destacados. A pesar de que hay unos rasgos comunes en muchas poblaciones de microorganismos de diferentes zonas, por ejemplo la presencia de poblaciones de levaduras apiculadas de grupo Kloeckera o Hanseniaspora, o de algunas especies anteriormente descritas como Candida stellata (que diferentes revisiones taxonómicas han reorganizado, siendo Candida zemplinina (Starmerella bacillaris) la más habitual en uvas), las cepas de dichas especies o las especies minoritarias aparecen de forma aleatoria, y suelen ser propias de cada zona. Esa composición de microorganismos, si se desarrolla libremente en un mosto (fermentación espontánea) acaba dejando un conjunto de características propias en el vino final, lo que podríamos definir como el “rastro” (en inglés footprint) microbiológico. Este planteamiento es el que ha dirigido la selección de levaduras autóctonas en el proyecto WILDWINE.

Aislamiento de levaduras autóctonas de la zona DOC Priorat

El aislamiento y selección de levaduras se ha realizado durante dos años consecutivos (2012 y 2013), en viñedos y bodegas pertenecientes a la DOC Priorat, mediante la toma de muestras de uvas o de fermentaciones espontáneas de esa zona. Las uvas recolectadas se dejaban fermentar libremente en presencia de pequeñas concentraciones de sulfuroso, en un ambiente estéril para evitar contaminaciones. Tanto en un caso como en otro se pudo observar la aparición de levaduras no Saccharomyces al principio de las fermentaciones, e incluso hasta en fases avanzadas de la fermentación, mientras que al final aparecían sólo levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, que dominaban la fermentación. Hasta aquí, nada que no supiéramos o no esperásemos, y que incluso, no hubiéramos descrito con anterioridad en la misma zona o similar (Torija et al.2001, Beltran et al. 2002). Quizás una pequeña salvedad fue la ausencia, casi total, de S. cerevisiaehasta bien entrada la segunda mitad de la fermentación. Las levaduras que encontramos fueron mayoritariamente de las especies Hanseniaspora uvarum y Candida zemplinina como también se ha descrito previamente (Torija et al. 2001). Además, en este aspecto hay alguna novedad: debido a que el proyecto implica a otras áreas más de Europa aparte del Priorat (Burdeos, Piemonte, Peloponeso y Creta), y que actualmente se dispone de técnicas moleculares de tipificación para estas especies no Saccharomyces (microsatélites, RAPD, etc.), se ha podido hacer un estudio comparativo entre las diferentes cepas de las especies aisladas (Masneuf-Pomerade et al. 2015). Las cepas aisladas en las diferentes zonas vitivinícolas son claramente diferentes genéticamente, si bien con los métodos moleculares empleados para su tipificación estas no se han podido agrupar según la zona de origen. Es decir, teniendo un perfil genético de alguna cepa no la podemos asociar inmediatamente a una zona geográfica de aislamiento. Finalmente, la mayor diferencia entre las zonas de estudio se encuentra en dos aspectos: en las levaduras minoritarias encontradas, que en las diferentes zonas estudiadas de Europa no son necesariamente las mismas (en nuestro caso, en la DOC Priorat hemos encontrado Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima, Issatchenkia terricola, Zygosaccharomyces sp, Pichia sp, Lachancea thermotolerans, etc.), y en las cepas presentes de cada una de las especies, que en general fue muy reducido, apareciendo prácticamente las mismas cepas mayoritarias en los dos años de estudio en una misma zona. La figura 1 muestra las cepas de H. uvarum aisladas en uvas y mostos de la DOC Priorat durante los dos años de estudio. La tipificación se realizó utilizando la técnica molecular RADP M13 (Fadda et al.2014).
Fig 1
Figura 1. Cepas de Hanseniaspora uvarum presentes en uvas y mostos de la DOC Priorat durante los años 2012 y 2013, estimadas en porcentaje sobre el total de aislados de esta especie [Clique sobre la imagen para ampliar]

Selección de cepas de Saccharomyces y no Saccharomyces y diseño del inóculo mixto para utilizarlo en vinificaciones industriales
Para seleccionar las cepas de levaduras que se utilizarían en las fermentaciones industriales, tanto de Saccharomyces como de no Saccharomyces, se realizaron una serie de pruebas fisiológicas en el laboratorio en medios de cultivo y microfermentaciones con medios naturales y sintéticos. Los criterios básicos para la selección se basaron en la capacidad fermentativa, la ausencia o baja producción de compuestos indeseables (acidez volátil, aminas biógenas, SH2, etc…), en la posible aparición de alguna actividad enzimática de interés (presencia de glucosidasas, pectinasas, esterasas, etc...), o bien la producción de compuestos de interés enológico (glicerol). También se tuvo en cuenta la presencia de esas cepas en las fermentaciones espontáneas de dónde se aislaron, así como, la capacidad de imponerse en estudios de competencia masiva. Estas pruebas se realizaron tanto en medios sólidos como en mostos, naturales o sintéticos, dependiendo de las características que nos interesaran.
Una vez seleccionadas las cepas que pudieran tener interés y desechadas aquellas que produjeran algún aspecto perjudicial, se diseñó un consorcio de levaduras no Saccharomyces y de diferentes cepas de la especie S. cerevisiae, para proceder a su uso en vinificaciones industriales reales. Para respetar al máximo la microbiota nativa y reproducir la huella microbiológica del Priorat era necesario mantener, en términos globales, las proporciones de las diferentes especies que se encontraban en las uvas autóctonas. A pesar de que estas proporciones cambian cada año y de un viñedo a otro, sí que hay una tendencias que son las que se utilizaron para realizar las mezclas de levaduras no Saccharomyces, con un mayoría de una cepa de H. uvarum (60%), que era muy mayoritaria en el Priorat, una proporción menor de otra cepa de C. zemplinina (30%) y finalmente T. delbrueckii y M. pulcherrima, estas en proporciones próximas al 5% del total del inóculo inicial. Para el inóculo con cepas S. cerevisiae autóctonas, se escogieron 3 cepas que se inocularon en partes iguales entre ellas (SFB1, SFB2, SL1) (fig. 2).
Fig 2
Figura 2. Diseño experimental y de muestreo de las fermentaciones realizadas en bodega con: a) inoculación secuencial de un consorcio de levaduras no Saccharomyces y Saccharomyces autóctonas, b) inoculación de una mezcla de levaduras Saccharomyces autóctonas, o c) inoculación de una única levadura Saccharomyces comercial [Clique sobre la imagen para ampliar]

Una de las limitaciones del trabajo con levaduras aisladas localmente de forma experimental es la producción de la biomasa necesaria para la inoculación en condiciones adecuadas. En primer lugar se trata de un problema de volumen de inóculo: en las condiciones habituales de trabajo en laboratorio hablamos en términos de volúmenes inferiores a un litro, mientras que en bodega podemos hablar en términos de mil litros como mínimo. Este problema de escalado es una primera limitación importante. Un segundo aspecto es la posible contaminación, ya que una pequeña contaminación de levaduras altamente fermentativas (como S. cerevisiae) durante la preparación de los inóculos conllevaría la práctica desaparición de las otras levaduras no Saccharomyces. Por lo tanto es necesario establecer las condiciones necesarias para trabajar con la máxima esterilidad así como establecer un sistema de control de calidad del producto. Es decir, tenemos que comprobar de nuevo por técnicas moleculares la presencia exclusiva de las cepas de nuestro interés en los inóculos que utilizamos. Evidentemente este tipo de producción de biomasa sólo se puede realizar en laboratorios o instalaciones especialmente diseñadas para ello, dada la gran facilidad de contaminación.

.......
. .
La Bodega Ferrer-Bobet, en Porrera (Priorat), ha colaborado en este estudio

Pruebas de inoculación mixta en bodega 
Una vez producido el inóculo de las levaduras en las proporciones determinadasde cada especieestasse inocularon a fermentaciones industriales de manera similar a como procede habitualmente la bodega colaboradora del Priorat (Bodega Ferrer Bobet). Se realizaron 2 pruebas independientes, una con garnacha tinta y otra con cariñena, y en cada una de ellas se ensayaron 3 combinaciones distintas (cada condición con 1050 L de mosto) (fig. 2). La primera combinación consistía en una inoculación secuencial: se inocularon las 4 especies de no Saccharomyces antes descritas y a las 24 h se inoculó una mezcla de 3 cepas autóctonas de S. cerevisiae. En la segunda combinación se inoculó desde un principio la mezcla de las 3 cepas autóctonas de S. cerevisiae, y en la última combinación sólo se inoculó la cepa de levadura comercial que habitualmente utiliza la bodega para cada una de las variedades. Debido a las particulares condiciones del viñedo del Priorat, esta bodega realiza vinificaciones separadas por parcelas, que en ocasiones pueden ser reducidas y, por lo tanto, tienen depósitos de pequeño volumen, lo que fue una buena ocasión para que el vino que pudiéramos producir fuera después comparable al vino industrial que ellos habitualmente producen. Por lo tanto, los vinos resultantes, se pudieron analizar detalladamente e incluso catar en condiciones completamente comparables a los vinos producidos después de una fermentación alcohólica.
Los resultados se pueden agrupar en dos aspectos; por un lado la evolución de las fermentaciones y de las poblaciones de levaduras, y por otro el aspecto sensorial. Con respecto a la evolución de las fermentaciones, en todos los casos las fermentaciones alcohólicas procedieron de forma efectiva y rápida, sin diferencias significativas respecto a la fermentación inoculada con la cepa comercial de S. cerevisiae. Por lo que respecta a la evolución de las poblaciones, hay que destacar que cuando se inocularon las especies no Saccharomyces estas aparecieron de forma considerable (estimadas en porcentaje sobre el total) hasta mitad de fermentación (fig. 3), mientras que cuando no se inocularon, estas especies ya no se encontraron a las 24 de haber inoculado Saccharomyces (ya sea la cepa comercial o de selección local). Así, pues se ratifica el hecho de la rápida desaparición de las levaduras no Saccharomyces en presencia de S. cerevisiae, por lo que los posibles efectos que pudieran realizar estas especies quedan reducidos a su mínima expresión. En cambio, cuando se produce la inoculación con levaduras no Saccharomyces, su presencia puede permitir su actuación hasta casi el final de la fermentación. Es importante remarcar que todas las colonias de S. cerevisiae aisladas al final de ambas fermentaciones, así como los aislados de H. uvarum, presentaron un patrón electroforético igual al de las cepas inoculadas, por lo que se puede deducir que las cepas inoculadas han sido las responsables principales de la fermentación.
Fig 3
Figura 3. Porcentaje de las diferentes especies de levaduras encontradas a lo largo de la fermentación realizada mediante inoculación secuencial de un consorcio de levaduras no Saccharomyces y Saccharomyces autóctonas, con la variedad garnacha. Los detalles de la inoculación y puntos de muestreo se indican en la figura 2

Por lo que se refiere al producto final, se han realizado catas triangulares y en diversas ocasiones se han obtenido resultados claros y significativos con respecto a la posible discriminación de estos vinos. A pesar de que en pruebas de preferencia sólo ha habido algún caso significativo (apuntando como preferidos los vinos con presencia de no Saccharomyces), es de destacar que el hecho de que los vinos realizados con las levaduras autóctonas seleccionadas no se diferencien de los realizados con las levaduras comerciales es señal de la alta calidad de los vinos producidos con estas levaduras.

Conclusión
En definitiva, es importante remarcar que las levaduras no Saccharomyces pueden tener una importancia en el mantenimiento, tanto de la diversidad en las bodegas durante las fermentaciones, como en las características organolépticas que pueden ser definitorias de la tipicidad de un vino. Por lo tanto, la incorporación de este consorcio levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces para fermentaciones alcohólicas industriales podría mejorar las características de los vinos resultantes, simulando una fermentación espontánea, pero con condiciones controladas desde el punto de vista cinético y microbiológico.
Asimismo, los vinos producidos con levaduras seleccionadas reúnen los niveles de calidad exigibles, como mínimo similares a los producidos con levaduras comerciales si no superiores. Se puede considerar, pues, que el proyecto WILDWINE ha cumplido con los objetivos propuestos por lo que respecta a la DOC Priorat.
Estas cepas se han depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) a nombre del Consejo Regulador de la DOC Priorat.

Agradecimientos
Este estudio se enmarca dentro del proyecto Europeo WILDWINE (Ref. 315065). Los autores quieren agradecer a la bodega Ferrer Bobet por su asistencia en las fermentaciones realizadas a escala industrial.
 
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10/3/16

Actividades enzimáticas de levaduras no Saccharomyces para su aplicación enológica


Ignacio Belda,1 Javier Ruiz,1 Alejandro Alonso,1 Domingo Marquina,1 Eva Navascués2 y Antonio Santos11Departamento de Microbiología III, Facultad de Biología, Universidad Complutense de Madrid
2 Agrovin, S.A., Alcazar de San Juan, Ciudad Real
El estudio de los procesos microbianos involucrados en la elaboración de vino, al margen de la bien conocida fermentación alcohólica, ha dado lugar a una extensa línea de investigación con las levaduras llamadas no Saccharomyces como centro de interés. El conocimiento sobre el potencial enzimático de las levaduras no Saccharomyces constituye un pilar fundamental que sustenta su interés en Enología para la mejora de las propiedades tecnológicas y sensoriales de los vinos elaborados en la industria.
Incremento del carácter varietal de los vinos
Enzimas glicosidasas para la liberación de aromas terpénicos
La importancia de los terpenos en el carácter varietal de ciertas variedades de uva blanca es bien conocido, siendo los descriptores principales de variedades como moscatel, riesling o alvariño (Marais, 1983), aunque recientemente ha sido considerada su presencia y relevancia en ciertas variedades de uva tinta. La composición en terpenos libres en los mostos es escasa, sin embargo, existe en estas variedades una cantidad notable de terpenos conjugados con azúcares en forma de compuestos glicosilados (Maicas y Mateo, 2005). Estos terpenos glicosilados pueden ser liberados por hidrólisis enzimática por acción de enzimas glicosidasas (Mateo y Di Stefano, 1998).
La revelación de compuestos aromáticos de tipo terpénico a partir de sus precursores glicosilados en la uva fue uno de los primeros abordajes en la investigación enológica de levaduras no Saccharomyces (Vasserot et al., 1989). La escasa actividad β-glucosidasa en condiciones enológicas de la inmensa mayoría de cepas de S. cerevisiae, necesaria para completar el proceso de liberación de aromas terpénicos glicosilados, ha conducido a la búsqueda de especies de levadura alternativas para una revelación más efectiva de estos aromas varietales.
La liberación de los compuestos terpénicos requiere de la actuación secuencial en dos pasos de dos enzimas hidrolíticas. El primer paso consiste en la actuación de una enzima β-xilosidasa, α-L-arabinofuranosidasa, α-ramnosidasa o β-apiosidasa según el azúcar que se encuentre unido al complejo terminal glucosa-terpeno (fig. 1).
Fig 1
Figura 1. Liberación enzimática de aromas terpénicos desde sus precursores glicosilados. Ejemplo de precursor unido a arabinosa y ruptura por a-L-arabinofuranosidasa [Clique sobre la imagen para ampliar]

El segundo paso, determinante para la liberación del aroma terpénico, es siempre llevado a cabo por β-glucosidasas. Aunque algunas cepas de S. cerevisiae son productoras de actividades glicolíticas como β-xilosidasa, apenas existen cepas con actividad β-glucosidasa (Ubeda-Iranzo et al., 1998; Van Rensburg et al., 2005), existiendo, en cualquier caso, una fuerte represión catabólica por la presencia de glucosa en el medio, lo que limita su utilidad a las etapas finales de la fermentación (Aryan et al., 1987, Gunata et al., 1993). Esta ausencia de actividades en S. cerevisiae conduce a la búsqueda de levaduras no Saccharomyces con estas actividades y, preferiblemente, con una menor represión por glucosa.
Así, son varios los estudios que han desarrollado procesos de selección de levaduras en base a estas actividades (Vasserot et al., 1989; Rosi et al., 1994; McMahon et al., 1999; Manzanares et al., 1999; Fernández et al., 2003; Mateo et al., 2011). Mendes-Ferreira et al. (2001) identificaron Kloeckera apiculataWickerhamomyces anomalus y Metschnikowia pulcherrima como potenciales candidatos para su uso en la liberación de terpenos por mostrar una intensa actividad β-glucosidasa.
.«Son pocos los trabajos científicos que reporten, a una escala industrial, el aumento de la complejidad en aromas terpénicos en los vinos por no Saccharomyces, por lo que su consecución supone un reto actual para la investigación enológica.»
«
Para que el potencial enzimático de estas especies pueda llegar a ser aplicado en la revelación aromática en vinos, las cepas que las presenten han de cumplir ciertos requisitos referentes a la alta afinidad sobre los derivados terpénicos glicosilados en la uva, una actividad óptima al pH del mosto, cierta resistencia a la represión por glucosa y una alta tolerancia al etanol. A este respecto cabe destacar los trabajos de Cordero-Otero et al., (2003) en los que pudieron identificar una cepa de Debaryomyces pseudopolymorphus que, además de mostrar alta actividad β-glucosidasa, previamente identificada en D. hansenii (Maicas y Mateo, 2005), presentó alta tolerancia a la presencia de glucosa y etanol en el medio generando un incremento notable de geraniol y citronelol en los vinos fermentados con esta especie de levadura.
Estudios realizados en nuestro grupo de investigación sugieren que la actividad β-D-xilosidasa, además de en S. cerevisiae, se encuentra ampliamente distribuida en la mayoría de especies de levaduras aisladas en ambientes enológicos. Por el contrario, la actividad α-L-arabinofuranosidasa se muestra como la más restrictiva en cuanto a su distribución entre las levaduras no Saccharomyces más habituales en enología, destacando la actividad de especies como W. anomalusM. guilliermondii, utilizadas hasta el momento con poco éxito en fermentaciones industriales.
En la actualidad son pocos o casi inexistentes los trabajos científicos que reporten, a una escala industrial, el aumento de la complejidad en aromas terpénicos en los vinos por no Saccharomyces, por lo que su consecución supone un reto actual para la investigación enológica.
β-liasas en enología para la liberación de aromas tiólicos
Las β-liasas, denominadas en enzimología cistationin-β-liasas o L-cistationina L-homocisteínα-liasas (CE 4.4.1.8), son enzimas que catalizan reacciones de eliminación beta de conjugados de cisteína que poseen un grupo aceptor de electrones unido en el azufre. Los productos finales de la reacción de las β-liasas son piruvato, amonio y un fragmento que contiene azufre (Cooper y Pinto 2005, 2006; Cooper et al., 2010.; Holt et al., 2012).
En la naturaleza existen una gran variedad de sustratos S-conjugados a cisteína que son sustratos de enzimas β-liasas, muchos de ellos se encuentran en alimentos como el ajo y la cebolla, generando su olor característico. En las uvas y mostos existen una serie de aromas ligados a precursores S-conjugados a cisteína, son los denominados aromas varietales tiólicos. Estos, como consecuencia de la actividad β-liasa de las levaduras, pueden producir aromas deseables en el vino cuyos descriptores principales son el aroma a pomelo, frutas tropicales y boj, característicos de vinos de variedades como verdejo o sauvignon blanc (Swiegers et al., 2007; Roncoroni et al., 2011).
Los tioles varietales principales, y mejor descritos en vinos blancos, son 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), 3-mercaptohexanol (3MH) y su derivado acetilado, 3- mercaptohexil acetato (3MHA) obtenido por acción de una alcohol acetiltransferasa, que se encuentran en la uva en forma de precursores no odorantes conjugados a cisteína y son liberados durante la fermentación alcohólica mediante la actividad β-liasa que presentan las levaduras (fig. 2).
Fig 2
Figura 2. Liberación de 3-mercaptohexanol, un aroma tiólico, por acción de la actividad ß-liasa de levaduras a partir de su conjugado cisteinilado natural (3-mercaptohexanol-L-cisteína) presente en el mosto de uva [Clique sobre la imagen para ampliar]

Los estudios realizados en mayor profundidad sobre esta actividad han sido realizados en S. cerevisiae, observándose la presencia de cepas con mayor o menor actividad β-liasa y, por tanto, con mayor o menor potencialidad a la hora de revelar aromas varietales tiólicos. Por esta razón, es muy ventajoso seleccionar y emplear aquellas levaduras con una elevada expresión de actividad β-liasa para obtener la máxima expresión del potencial aromático tiólico del mosto (Howell et al., 2004; Howell et al., 2005.). Son distintos genes (BNA3CYS3GLO1IRC7, STR3) los que han sido descritos como implicados en la liberación de aromas tiólicos en S. cerevisiae (Thibon et al., 2008), pero IRC7 y STR3 parecen ser los responsables directos de la liberación de dichos aromas en base a la codificación de enzimas β-liasas (Roncoroni et al., 2011). El enzima β-liasa codificado por IRC7parece ser el más activo de todos ellos estando directamente relacionado con la liberación de 4MMP.
Se acepta de manera casi general que la conversión de los precursores cisteinilados en sus correspondientes aromas tiólicos es muy limitada durante la elaboración de vino, típicamente inferior al 10%, por lo que se pone de manifiesto que las cepas de S. cerevisiae más eficaces no son capaces de completar la transformación de una parte significativa de los precursores de aroma unidos a cisteína. Además, se ha descrito que la actividad β-liasa está regulada negativamente mediante un mecanismo denominado represión catabólica por nitrógeno, por lo que en presencia de nutrientes nitrogenados la levadura libera en menor medida dichos aromas (Swiegers y Pretorius 2007; Harch y Gardner 2013).
No se han realizado estudios específicamente dirigidos a estudiar el potencial revelador de aromas tiólicos en diversas especies no Saccharomyces, y por tanto, los datos disponibles en la actualidad, a menudo empíricos, tan solo corresponden a los obtenidos al observar las propiedades enológicas de ciertas levaduras no Saccharomyces comercializadas por distintas casas comerciales. Por ejemplo, la levadura Torulaspora delbrueckii NS-TD comercializada por Agrovin, S.A. y cuya fisiología en fermentación ha sido recientemente descrita (Belda et al., 2015a), muestra una elevada actividad β-liasa, incluso superior a la mostrada por cepas de S. cerevisiae descritas como muy recomendadas para potenciar estos aromas tiólicos en vinos blancos.

Mejora de propiedades tecnológicas de los vinos
Enzimas pectinasas en enología
Los enzimas pectinolíticos presentan un gran interés en la mejora de ciertos aspectos tecnológicos y sensoriales en la elaboración de vino, influyendo en el proceso de clarificación y en la filtrabilidad de mostos y vinos, así como en la liberación de compuestos aromáticos y de color presentes en la uva (Fernández-González et al., 2005). Esta liberación es posible gracias a su actuación hidrolítica sobre los polisacáridos pécticos que constituyen la pared de las células vegetales (fig. 3). Tradicionalmente, los complejos enzimáticos de origen fúngico con actividad pectinolítica son aplicados tanto en etapas prefermentativas como postfermentativas (Kashyap et al., 2001) por su contribución en la mejora de procesos de clarificación, extracción durante la maceración o la filtrabilidad de los vinos. Estos preparados enzimáticos contienen en general una mezcla de actividades pectín liasa, pectín metilesterasa y poligalacturonasa (Lang y Dornenburg, 2000). De estos, dos tipos de poligalacturonasa, endo y exopoligalacturonasa, son los principales responsables de la actividad pectinolítica en vinos y, por ello, dichas actividades han recibido mayor interés por parte de científicos e industria (Torres et al., 2006).
Fig 3
Figura 3. Hidrólisis enzimática de polisacáridos pécticos (ácido poligalacturónico) por acción de enzimas pectinolíticos [Clique sobre la imagen para ampliar]

La adición de estos preparados enzimáticos fúngicos constituye un coste significativo para las bodegas, por lo que la búsqueda de levaduras capaces de producirlas constituye un objetivo interesante. Sin embargo, se ha descrito que al menos un 75% de las cepas enológicas de S. cerevisiae presentan una actividad pectinolítica muy limitada. En este contexto se han desarrollado un gran número de cepas recombinantes de S. cerevisiae con actividades pectinasas heterólogas más eficientes mediante ingeniería genética del gen PGU1 de S. cerevisiae (Blanco et al., 1998; Gognies et al., 1999, 2001; Jia y Wheals, 2000; Vilanova et al., 2000; Gainvors et al., 2000; Blanco et al., 2002; Fernández-González et al., 2004, 2005). Sin embargo, la falta de aceptación de organismos genéticamente modificados en la industria enológica obliga a la búsqueda de levaduras naturales como fuente alternativa de enzimas pectinolíticos (Charoenchai et al., 1997; Strauss et al., 2001).
Resultados recientes confirman la efectividad del uso de levaduras no Saccharomyces para la mejora de parámetros como la extracción de polifenoles, antocianos y otros pigmentos, o la contribución a la mejora de la turbidez y filtrabilidad de los vinos (Belda et al., 2015b). Los resultados, en vías de publicación, obtenidos en nuestro grupo de investigación confirman que la actividad poligalacturonasa de M. pulcherrima es efectiva para la mejora de los citados parámetros en la elaboración de vinos tintos tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Estos resultados, además, confirman la influencia de la temperatura en la efectividad de dichos enzimas, siendo favorable las temperaturas bajas para la actuación de los enzimas pectinolíticos, aumentando el tiempo de contacto de los hollejos que permite una mayor hidrólisis de las paredes celulares.
Los resultados sugieren que, además de estas razones estrictamente químicas, los procesos de maceración fría contribuyen a la extracción de color por el mayor desarrollo de levaduras no Saccharomyces con actividades pectinolíticas. De un total de 16 especies de levaduras analizadas, aisladas de ambientes enológicos, tan solo Aureobasidium pullulans, M. pulcherrima y M. fructicolamostraron actividad poligalacturonasa. Otros estudios han descrito la presencia de dicha actividad en cepas de Meyerozyma guilliermondii y D. hansenii pero de orígenes no enológicos (Sanchez et al., 1984) y en un número muy limitado de cepas de las especies Candida stellata, C. oleophila, C. valida y K. apiculata, pero no describiendo un comportamiento característico de especie (Strauss et al., 2001).
Enzimas proteolíticos para la prevención de la quiebra proteica
Los problemas de inestabilidad o quiebra proteica en los vinos blancos constituyen un inconveniente en la calidad de los vinos en lo que respecta a su percepción visual. La aparición de la quiebra proteica puede solucionarse mediante la eliminación de las proteínas de la uva que siguen presentes tras el proceso de fermentación (Sluyter et al., 2015).
Las proteínas responsables de la aparición de la turbidez característica de la quiebra proteica son, en general, relacionadas con ciertas patologías de la uva, altamente estables durante la elaboración del vino, pero que terminan por precipitar con el paso del tiempo. La eliminación de proteínas se logra actualmente mediante la adición de bentonita, un proceso no del todo eficiente que implica un coste considerable para las bodegas no ausente de inconvenientes sensoriales para el vino.
El uso de enzimas proteasas para la degradación de estas proteínas se postula como una alternativa al uso de la bentonita con menor incidencia sobre la calidad final de los vinos. Su adición durante el proceso de fermentación puede contribuir en cierto grado a la liberación de péptidos y aminoácidos fácilmente metabolizables por las levaduras como fuente de nitrógeno, contribuyendo a mejorar los desequilibrios nutricionales del mosto y disminuir la necesaria adición de nutrientes, mejorando el perfil sensorial de los vinos (Guitart et al., 1999; Pretorius et al., 2000). La adición de enzimas proteolíticas en la industria es frecuente en procesos como la elaboración de cerveza, en la que el uso de papaína, una cistein-proteasa procedente de la papaya, ha sido probado, constituyendo una opción viable en su uso en la elaboración de vino (Rehmanji et al., 2005).
A este respecto y, partiendo de la ausencia de actividad proteasa en la inmensa mayoría de cepas de S. cerevisiae, cabe destacar el potencial de W. anomalus como levadura productora de enzimas proteolíticas, siendo también notable el potencial de cepas de M. pulcherrima o K. marxianus, ambas descritas como poseedoras de características metabólicas óptimas para un aumento de la calidad del vino en su uso combinado con S. cerevisiae. Apenas existen experiencias sobre el uso de levaduras como fuente de enzimas proteolíticos para el control de la inestabilidad proteica en vinos. Los estudios llevados a cabo por Dizy y Bisson (2000) indican la ausencia de una efectividad significativa en el uso de levaduras no Saccharomyces para la degradación proteica, por lo que es necesario continuar profundizando en el estudio de esta actividad enzimática para su aplicación enológica y cuya optimización puede constituir un nuevo pilar que sustente el uso de levaduras no Saccharomyces en bodega.

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