29/1/18

Biosensores, actores de la revolución 4.0


Asier Albizu Biolan. Parque Tecnológico de Bizkaia
Zamudio, Bizkaia
La cuarta revolución industrial, también conocida como Industria 4.0, lleva varios años implantándose en sectores industriales que tradicionalmente han ido por delante en el desarrollo tecnológico. Algunas de las claves de esta revolución industrial son la digitalización, el trabajo en la nube y la manufactura avanzada, pero para poder implementarla es fundamental contar con información que procesar, y para ello la sensóricatiene un papel fundamental como pieza clave para monitorizar, generar y capturar gran cantidad de información.
 «La biosensórica es una solución imbatible para la medida y captura de información de diferentes parámetros de interés.»
 
La sensórica puede basarse en diferentes tecnologías, como son la óptica, la electrónica y la visión artificial, entre otras. Las plataformas de sensórica más avanzadas son capaces de conjugar diferentes tecnologías y aprovechar las ventajas que cada una de ellas aporta. En este sentido, la biosensórica, basada en tecnología electroquímica, necesita la electrónica y la biotecnología para ser eficaz. Este conjunto de tecnologías convierte a la biosensórica en una solución imbatible para la medida y captura de información de diferentes parámetros de interés. La tecnología biosensórica tiene tres características que la convierten en una solución atractiva, como son la rapidez de la medida, la facilidad de uso y la precisión.
El sector vitivinícola no ha sido una excepción y progresivamente se han ido implantando procesos que generan información de elevado interés para el control de producto y del proceso de producción. Tradicionalmente se vienen aplicando diferentes tecnologías provenientes de otros sectores, como son las tecnologías NIR o los sistemas enzimáticos colorimétricos, y desde hace aproximadamente 10 años también la tecnología biosensórica, nacida propiamente del sector vitivinícola de la mano de BIOLAN Microbiosensores, y exportada posteriormente a otros sectores alimentarios.

Cómo funciona un biosensor
Un biosensor se define como una herramienta analítica para la cuantificación de moléculas de interés que consta de dos partes diferenciadas:
• Un elemento de reconocimiento biológico ERB (molécula biológica que interacciona con el analito: enzimas, anticuerpos, fragmentos de DNA…).
• Un dispositivo para la transducción de la señal biológica (la transducción puede ser electroquímica, óptica, colorimétrica,…).
Los biosensores de Biolan se definen como enzimático amperométricos, es decir, enzimáticos porque se usan enzimas para que interaccionen con el analito de interés, y amperométricos porque la transducción de la señal biológica es electroquímica (es decir, la interacción enzima-analito se traduce en una señal electroquímica, más concretamente amperométrica, corriente eléctrica).
Esta tecnología se basa en la especificidad y selectividad de enzimas para cada analito y la posterior transducción de esa señal biológica en corriente fácilmente detectable y cuantificable.
Las medidas se realizan sobre una celda electroquímica, la celda de medida, que básicamente es un circuito que consta de tres electrodos por lo que circula corriente eléctrica tras la aplicación de un potencial. Dicha celda es una cubeta de plástico que alberga los cinco elementos imprescindibles en la medida: el electrodo de trabajo (Biotest), el electrodo de referencia, un contraelectrodo, una varilla agitadora y la solución de medida.
Dependiendo del desarrollo en concreto, el potenciostato aplica un potencial determinado, y se establece un flujo de corriente entre los tres electrodos de la celda. Este flujo de electrones, tras unos segundos de estabilización, se mantiene constante con el tiempo (el potenciostato es capaz de determinar el valor de la corriente en cada fracción de segundo).
Cuando se inyecta la muestra (en este caso, mosto o vino), la enzima cataliza la oxidación de las moléculas del analito inyectado, se liberan electrones, y dichos electrones son detectados por el potenciostato. Estos electrones suponen un aumento en la intensidad de corriente sobre nuestro sistema de electrodos, es decir, se produce un salto en la intensidad de corriente, salto que será mayor cuanto mayor sea la concentración del analito en la muestra problema.
El equipo es capaz de traducir ese aumento de electrones en el sistema como concentración en unidades de mg/l (ppm) de analito analizado, gracias a una calibración previa del equipo.
El sector vitivinícola de gran tradición y con un alto conocimiento científico-tecnológico tanto desde el punto de vista agronómico como enológico, no puede quedarse fuera de esta nueva revolución industrial 4.0 y no solo debe ser capaz de adaptarse pasivamente a las últimas tendencias en la materia sino que estratégicamente debe adoptar un rol proactivo que le posicione competitivamente en un entorno global y cambiante, lleno de oportunidades, también tecnológicas.

Biosensores BIOWINE para una monitorización competitiva
Desde su origen, e incluso como razón del mismo, BIOLAN Microbiosensores detectó una necesidad patente en el sector vitivinícola de disponer de mejores soluciones de monitorización, competitivas, precisas, rápidas y sencillas que permitan cuantificar los parámetros de interés para una mejor gestión y calidad de su producción. Resolver esa problemática ha sido el gran reto de BIOLAN, y como consecuencia, actualmente BIOLAN ofrece al sector un total de siete biosensores para la determinación de otros tantos analitos, los de mayor relevancia para la industria vitivinícola.
Precisamente, el origen de la empresa BIOLAN vino marcado fundamentalmente por el desarrollo de la medida de ácido glucónico en uva, mosto y vino. Este parámetro, reconocido como de gran relevancia por algunos expertos, era por el contrario muy controvertido en muchos ámbitos enológicos en los inicios de esta andadura.
El desarrollo de este parámetro respondía a la necesidad de objetivar la calidad, o más bien, el estado sanitario de la uva en vendimia, si bien, en aquel momento, había diferentes indicadores y tecnologías que marcaban tendencia, y que no eran precisamente el ácido glucónico. Probablemente la ausencia de tecnologías capaces de medir de forma precisa, y sobre todo rápida, en el proceso de recepción de uva condicionaba el uso de este parámetro.
En cualquier caso, desde la aparición del método biosensórico, la medida del ácido glucónico se ha convertido en un habitual a la hora de calificar la calidad de la uva, de los mostos e incluso de los vinos comercializados, fundamentalmente a granel.
Las ventajas que ofrece el uso de biosensores son la rapidez de la medida, la posibilidad de medir de forma individual cada muestra a la llegada de cada remolque, camión, tractor… junto con su exactitud, ya que cuantifica de forma extraordinaria, pudiéndose además utilizar diferentes rangos de medida, dependiendo de las necesidades, exigencias, coyunturas, zonas geográficas, variedades etc., que cada usuario pueda necesitar.
Este sistema de medida es ya utilizado de forma regular en zonas vitivinícolas tan diversas como Cataluña, La Rioja, diversas zonas vitivinícolas españolas, Francia, Portugal, Chile, Argentina, Brasil y California. En algunas de estas zonas, el ácido glucónico era el gran desconocido entre los indicadores de calidad en la elaboración del vino.
Otro parámetro, que por lo complicado de su desarrollo, adquiere un valor especial, es el ácido málico. Este desarrollo aporta una evidente mejora en la rutina que existía en diferentes latitudes vitivinícolas.
Este parámetro ha generado habitualmente problemas de cuantificación en concentraciones bajas, fundamentalmente en finales de fermentación maloláctica, cuando la toma de decisiones adecuadas es clave en el proceso de vinificación.
La tecnología biosensórica permite cuantificar de forma precisa el nivel de ácido málico en concentraciones por debajo de 1 g/l, de forma que el enólogo mediante un análisis que se realiza en tan solo dos minutos puede tomar decisiones basadas en información precisa a tiempo real.
El tercer parámetro de interés a destacar es el de los azúcares que se determinan al final de la fermentación alcohólica, cuando esta tecnología también ofrece la posibilidad de cuantificar. Al igual que en el caso del ácido málico, este sistema permite medir de forma precisa, rápida y sencilla la concentración de azúcares en el final de fermentación. Así, el enólogo puede decidir de forma inmediata y eficaz la concentración de azúcares deseada en cada vino que se elabora, sin la necesidad de enviar muestras a laboratorios externos o de medir con sistemas poco precisos.
Además de los parámetros mencionados, existen biosensores para la determinación de ácido láctico, sacarosa, histamina y sulfito, que aun no siendo tan extendidos, resuelven una demanda muy específica proveniente del sector.

Biosensores BIOWINE para cada problemática identificada
Actualmente se están comercializando tres modelos diferentes de equipos biosensores para atender a las diferentes realidades de este sector. Estos modelos se adaptan tanto al variable tamaño de las bodegas, como a los diferentes momentos que se dan en el proceso de cosecha y vinificación (fig. 1).
Figura 1. Equipos BIOWINE 300, BIOWINE 500 y BIOWINE 700.

El BIOWINE 300 es un equipo robusto, multiparamétrico, idóneo para bodegas medianas y grandes que necesitan medir diferentes parámetros de interés en diferentes momentos del año. Este equipo es adecuado para controlar el estado sanitario de la uva a la entrada en bodega, mediante el análisis de la concentración del ácido glucónico, también se aplica al control de los procesos de fermentación, mediante la medida de azúcares finales y de ácido málico, a la medida de sacarosa en los procesos de producción de vinos espumosos, y la concentración de histamina en cualquier tipo de vino.
Todos estos parámetros pueden ser medidos en cualquier otro momento en el que su monitorización pueda ser de interés, ya que los rangos de detección pueden ser modificados de forma sencilla, pudiendo por ejemplo realizarse la medición de la concentración del ácido málico en uva de forma previa a la cosecha en concentraciones más altas, de hasta 4-5 g/kg, que las perseguidas en el final de la fermentación maloláctica, por debajo de 1 g/l.
El BIOWINE 500 es un equipo dirigido fundamentalmente a bodegas grandes y muy grandes, para la medida de ácido glucónico en recepción de uva. Es un equipo automático que mide de forma precisa, rápida y automática los niveles de ácido glucónico en uva, de forma que esta puede ser seleccionada y parametrizada en el punto de recepción de la uva, donde el biosensor puede ser implementado e integrado con otros equipamientos.
La última novedad es el BIOWINE 700. Se trata de un equipo miniaturizado, totalmente portátil y pensado para bodegas pequeñas y muy pequeñas, así como para unidades de bodegas que por su actividad deben ser muy ágiles y donde la portabilidad aporta un valor añadido. En la actualidad, este equipo está optimizado para la medida de ácido málico y azúcares, y en un futuro, se ampliará a nuevos parámetros de forma análoga al BIOWINE 300.

 
 
CEVIPE, Bodegas Concha y Toro y la URV apostaron con visión de futuro por la innovación y credibilidad que proporciona esta tecnología.
Tecnología BIOWINE ampliamente validada
Las técnicas analíticas que aportan innovación a los diferentes sectores productivos cuentan con una importante barrera de entrada: la validación del método que debe aportar credibilidad y garantía. Por ello, en BIOLAN se apostó desde el primer momento en la consecución de certificados o validaciones externas con entidades de reconocido prestigio, que permitieran su acceso al mercado.
Las soluciones, una vez desarrolladas y validadas internamente, han sido evaluadas por diferentes entidades de referencia, destacando las validaciones externas realizadas por el CIVC (Centro Interprofesional del Vino de Champagne) y la URV (Universidad Rovira i Virgili). Igualmente, se han realizado trabajos de validación y adaptación con diferentes bodegas, entre las que destacamos los trabajos realizados por la Cooperativa de Vinos de Labastida, Solagüen en Rioja Alavesa, la colaboración con la cooperativa CEVIPE de Cataluña o la implementación de la tecnología biosensórica en la totalidad de las bodegas del grupo Concha y Toro.
Adicionalmente, en sectores agroalimentarios diferentes al vitivinícola, esta misma tecnología ha obtenido certificados de prestigio internacional que validan esta solución tecnológica al máximo nivel. En esta línea, podemos destacar la certificación otorgada por la Asociación americana “AOAC International”.
El AOAC Research Institute tiene como objetivo principal la creación, validación y publicación mundial de métodos de ensayo analíticos fiables, sobre todo para evaluar la seguridad de los alimentos, bebidas,  suplementos dietéticos y materiales similares consumidos por los seres humanos y los animales, o para evaluar la pureza de los materiales utilizados en producción de productos alimenticios y de sus ingredientes. 

  
BIOLAN 4.0: biosensórica avanzada y transformación digital
El camino recorrido en el sector tiene que continuar y el reto al que nos enfrentamos es muy importante. La cuarta revolución industrial, donde la digitalización, el Big Data, la fabricación avanzada… van a ser ámbitos de conocimiento cada vez más generalizados, debe ser asumida como una oportunidad para la mejora de la competitividad. Es la revolución 4.0.
Esta revolución debe ser afrontada, por un lado, desde la perspectiva de fabricante, mejorando capacidades y soluciones, fundamentalmente aplicando soluciones de fabricación avanzada, que nos van a permitir utilizar diferentes materiales que aportarán ventajas a nuestros equipos, o la utilización del Big Data para acortar los tiempos de análisis por debajo del minuto. En este mismo sentido, ya hemos comenzado a incorporar en el BIOWINE 700, equipo miniaturizado, nuevas aplicaciones que van a seguir facilitando el trabajo a los profesionales del sector vitivinícola.
Por otro lado, tenemos que considerar la perspectiva de nuestros clientes, consiguiendo que la información que generan nuestros sensores pueda ser utilizada de forma eficaz y on line. Para ello, la utilización de la nube digital, apps, páginas web interactivas… son algunas de las implementaciones en las que tenemos que trabajar (fig. 2).
Figura 2. BIOLAN 4.0.

BIOLAN, ejemplo del compromiso del sector con las start-ups
El tamaño sí importa, y la edad también, especialmente en algunos sectores. La innovación tecnológica y el emprendizaje son términos de nuevo cuño, pero utilizados tal vez, con demasiada ligereza. Cuando arrancamos en el año 2009 con el proyecto BIOLAN, creíamos firmemente en ambos paradigmas: innovación tecnológica y emprendizaje. Además, el entorno estaba impulsando desde diferentes ámbitos, el desarrollo de ambos conceptos en la convicción de que la conjunción de los mismos se debía traducir en valorizar el conocimiento para alcanzar negocios de éxito. Si bien no se contemplaba en ningún caso un plan de contingencia, es decir, nadie hablaba sobre qué hacer en caso de no tener éxito.
Por otro lado, este tipo de iniciativas, deben contar con el compromiso cierto y real de los sectores afectados para poder facilitar este complicado trayecto. Y en estos sectores debe haber personas comprometidas en estos dos paradigmas, imprescindibles para que los mismos puedan ser punteros y puedan encabezar los ránquings de innovación y por lo tanto de viabilidad futura.
En el caso de BIOLAN, hemos tenido la fortuna de contar, especialmente, con tres entidades que han creído y ayudado en nuestra solución y a las que no podemos dejar de reconocer su aportación.
En primer lugar queremos reconocer el apoyo que desde el primer día la bodega chilena Concha y Toro nos ha dispensado, accediendo a probar todas las nuevas aplicaciones que hemos ido desarrollando para equipar finalmente todas sus bodegas con tecnología BIOLAN. Esta bodega nos ha ayudado a completar las diferentes fases de madurez tecnológica necesarias en todas las propuestas tecnológicas en las que hemos participado hasta el momento actual.
En segundo lugar, la Cooperativa catalana de segundo grado CEVIPE (Centre Vinícola del Penedès) ha sido determinante en la implantación de la técnica biosensórica y en su apuesta por el apoyo a la innovación en el sector vitivinícola. Desde CEVIPE han sabido fomentar la calidad de su producción con una visión de futuro, lo cual les posiciona a la cabeza del sector en control de calidad y por lo tanto en la excelente selección de sus producciones.
Por último, querríamos también reconocer la labor a favor de la innovación, que desde la Universitat Rovira i Virgili han desempeñado, apoyándonos constantemente en esta andadura. Es cierto que las universidades y los centros tecnológicos llevan en su DNA la innovación, pero en el caso de la URV nosotros lo hemos percibido con meridiana claridad.
Todos ellos son un ejemplo del sector que apuesta y apoya la innovación tecnológica, y por tanto son los verdaderos actores de que la revolución industrial 4.0 sea también una realidad en la industria vitivinícola. BIOLAN, nuevamente para esta carrera hacia la transformación digital y la producción avanzada, trabajará de la mano del sector, aunando esfuerzos y adaptando las soluciones tecnológicas a la realidad y casuística sectorial.

23/1/18

Aplicación de levaduras no-Saccharomyces en enología


Jordi Tronchoni, Pilar Morales y Ramon González Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (CSIC-UR-CAR)
Finca La Grajera
Logroño, La Rioja
Las no-Saccharomyces en enología
En enología, el término no-Saccharomyces engloba a todas aquellas levaduras de diferentes géneros que están presentes en el mosto durante las primeras fases de la fermentación, antes de que Saccharomyces cerevisiae las desplace, siendo esta última especie la que se encuentra mayoritariamente al final de la fermentación. El término no-Saccharomyces ha pasado de emplearse casi exclusivamente para levaduras que se consideraban como alterantes de la calidad, a estar cada vez más ligado a un grupo de levaduras que pueden contribuir positivamente, al aportar variabilidad y tipicidad, y que constituyen una fuente de innovación enológica.
Disponibilidad de las levaduras no-Saccharomyces
A pesar de que en los últimos años estamos asistiendo a un mayor reconocimiento del papel de estas levaduras en la elaboración del vino, en realidad hace ya casi 15 años que están en el mercado (en 2003 apareció a la venta Torulaspora delbrueckii y Kluyveromyces thermotolerans (ahora Lachancea thermotolerans) en el catálogo de un productor comercial de levaduras.
Inicialmente se pusieron a la venta como cultivos iniciadores mixtos en los que se encontraban estas no-Saccharomyces junto a S. cerevisiae. Con el paso de los años, hemos visto cómo cada vez más empresas ofrecían nuevas especies de levaduras en sus catálogos. Hoy en día, no solo encontramos la posibilidad de adquirirlas a través de diferentes empresas y distribuidores tanto internacionales como nacionales (tabla 1), sino que además existen pequeñas compañías especializadas en la producción de levadura a demanda, que incluyen las no-Saccharomyces en su oferta; y centros de investigación especializados en microbiología del vino que también proporcionan este servicio.
Tabla 1. Algunas especies de levaduras comercializadas como LSA para uso enológico
Cepas comerciales
Atributos por los que se comercializan
Torulaspora delbrueckiiMejorar aroma y complejidad en boca de tintos y blancos
Lachancea thermotoleransProductora de ácido láctico, proporciona redondez y equilibrio ácido al vino
Torulaspora delbrueckii /Saccharomyces cerevisiaeIncrementa la complejidad vínica proporcionando aromas frutales
Metschnikowia pulcherrimaMejora de aromas varietales, así como terpenos y tioles
Metschnikowia fructicolaProtección natural contra la contaminación por microorganismos, permite reducir el uso de sulfuroso
Pichia kluyveriMejora de aromas varietales, así como tioles
Schizosaccharomyces pombePermite la desacidificación maloláctica

Precisamente la elaboración y distribución de estas levaduras como levadura seca activa (LSA) es una de las limitaciones que existen en su producción, ya que diferentes géneros de levaduras requieren diferentes condiciones de producción. Además, el proceso de producción de LSA incluye fases en las que las levaduras son sometidas a un gran estrés, y si bien este proceso ha sido muy optimizado para S. cerevisiae, consiguiendo grandes rendimientos de supervivencia de la levadura tras la rehidratación, no lo está tanto para las no-Saccharomyces. Aun así y siempre que los rendimientos sean aceptables será mucho más práctico proporcionar la levadura en forma de LSA, al ser un formato más estable, duradero y económico, que la levadura fresca, menos estable a pesar de que se consigan mejores viabilidades.
Actualmente, para el uso de estas levaduras como cultivos iniciadores se sigue un procedimiento secuencial, de modo que tras la adición de la no-Saccharomyces se deja fermentar unos días (de dos a cuatro según las diferentes empresas) y se inocula S. cerevisiae, que será la encargada de terminar la fermentación, desplazando casi por completo a las levaduras anteriores. En la inoculación secuencial es necesario agregar nuevas fuentes de nitrógeno en la segunda inoculación para asegurar un correcto crecimiento de S. cerevisiae. Cuando no se realiza esta corrección se suelen observar problemas de imposición para S. cerevisiae, ocasionando paradas o ralentización de la fermentación.

Las levaduras no-Saccharomyces como herramienta de mejora en la fermentación y diversificación del producto
Tal como hemos dicho anteriormente, dentro del término no-Saccharomyces se incluye a un gran número de diferentes géneros y especies de levadura, cada cual con características metabólicas particulares, capaces de aportar su impronta al vino. Es precisamente esta diversidad la que ha permitido usar levaduras no-Saccharomyces como herramientas con las que mejorar la fermentación vínica, proporcionando la posibilidad de crear productos más complejos, que recuperen parte de la originalidad de las fermentaciones espontaneas (cuando éstas acaban bien) y que algunas echan en falta en los vinos fermentados con cepas iniciadoras de S. cerevisiae.
El uso de cultivos iniciadores, que combinen cepas de no-Saccharomyces con cepas de S. cerevisiae, o su uso en inoculación secuencial, se postula como una alternativa a la recuperación de la variabilidad que existe en los cultivos “naturales” durante fermentaciones espontaneas, pero sin los problemas que pueden aparecer en éstos, como pueden ser las paradas de fermentación o la aparición de defectos sensoriales. En la medida en la que se busca imitar en cierta forma una fermentación espontánea, se trata de una tendencia que el consumidor final del vino también puede encontrar atractiva, al combinar la innovación con el respeto a la tradición.
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Figura 1. Aspectos de la calidad del vino que pueden modularse
mediante el uso de levaduras no-Saccharomcyes
Las áreas en las que las levaduras no-Saccharomyces pueden ser interesantes por lo que aportan al vino son varias (fig. 1). Una de las principales es indudablemente el aroma, y también una de las primeras que se han estudiado. En el vino, se consideran aromas primarios aquellos que derivan de las uvas, mientras que los aromas secundarios derivan del metabolismo de las levaduras.
Varios de estos compuestos aromáticos de la uva están presentes en forma de precursores glucosilados que, al no ser volátiles, carecen de aroma, y que pueden ser hidrolizados por el enzima β-glucosidasa, normalmente en combinación con otras glucosidasas, para formar volátiles libres que contribuirán al aroma del vino.
El problema es que tan solo unas pocas cepas de S. cerevisiae poseen en su genoma genes que codifiquen estas funciones. En cambio, varios de los géneros de no-Saccharomyces sí los poseen. Los podemos encontrar, por ejemplo, en especies de los géneros DebaryomycesHansenulaCandidaPichia o Kloeckera. En todas ellas, estas actividades contribuyen a liberar compuestos volátiles que mejoran el aroma y la complejidad de los vinos, partiendo de precursores no aromáticos.
Por ejemplo, en el caso de Debaryomyces, una cepa de Debaryomyces vanriji aislada de uva, en estudios en cocultivo con S. cerevisiae permitió obtener vinos con un incremento en geraniol que se ligó a la acción de la β-D-glucosidasa. En fermentaciones con chardonnay, el cocultivo con la cepa industrial de S. cerevisiae VIN13 de una cepa de Debaryomyces pseudopolymorphus incrementó las concentraciones de citronellol, nerol y geraniol.
También existen ejemplos de aumento de tioles volátiles cuando se usa una cepa de Candida zemplinina, aunque en este caso son otros los enzimas implicados. En algunos casos, estos estudios han dado lugar a la comercialización de cepas que ya se pueden encontrar en el mercado, como es el caso de una cepa de Metchnikovia pulcherrima y otra de Pichia kluyveri, ambas recomendadas por el impacto positivo que tienen sobre la generación de terpenos y tioles (Padilla et al. 2016).
Es importante recordar que existen levaduras dentro del género Saccharomyces, distintas de S. cerevisiae, que también producen estos enzimas (Saccharomyces ludwigiiSaccharomyces pararoseus). No hay que olvidar que, aunque se habla de las no-Saccharomyces como alternativas a S. cerevisiae como cultivos iniciadores, existen grupos de investigación en España que investigan sobre otras levaduras del género Saccharomyces, cuyos estudios muestran que también pueden aportar interesantes características al vino (Gamero et al. 2013).
«En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído.».
 
Los cocultivos de no-Saccharomyces con S. cerevisiaetambién se han usado para controlar la acidez volátil en el vino. En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído, incluso partiendo de mostos botritizados.
A pesar de que el impacto de los cultivos mixtos se ha estudiado principalmente por la capacidad de las no-Saccharomyces para influir sobre la composición aromática, existen numerosos trabajos que ponen el foco sobre otros metabolitos importantes en la fermentación. En el caso del glicerol, se ha visto que cepas de C. zemplinina producen vinos con mayor cantidad de este metabolito o que el cocultivo con cepas de Pichia fermentans o L. thermotolerans producen menos ácido acético y un incremento de la acidez volátil junto al glicerol. Existen también ejemplos de cómo las no-Saccharomyces pueden ser beneficiosas para incrementar la producción de manoproteínas, o actuar positivamente sobre la estabilización del color, incluso en vinos espumosos, mejorando las características de la espuma (Medina-Trujillo et al. 2017).
No-Saccharomyces y vinos con menor grado alcohólico
Recientemente el empleo de las no-Saccharomyces se ha propuesto para disminuir el grado alcohólico. Las diferencias metabólicas que existen entre las no-Saccharomyces y S. cerevisiaehacen que estas levaduras puedan suponer una mejor alternativa al intento de disminuir el grado alcohólico mediante el uso de cepas de S. cerevisiae que tengan una menor producción de etanol. Al fin y al cabo, los fenómenos de domesticación y adaptación a la fermentación alcohólica y la producción de vino de S. cerevisiae, la han convertido en una de las levaduras con mayor eficiencia alcohólica. Siendo por tanto más interesante buscar en la diversidad de las no-Saccharomyces una respuesta a la reciente problemática del aumento del grado alcohólico.
En nuestro grupo hemos desarrollado y optimizado un protocolo para la inoculación secuencial de cepas de levaduras pertenecientes a T. delbrueckii y M. pulcherrima junto a S. cerevisiae para obtener vinos con menor grado alcohólico. Durante los primeros días de fermentación y mediante el uso de aireación, permitimos a las no-Saccharomyces respirar en vez de fermentar los azucares de la uva. Una vez se han consumido parte de estos azúcares, inoculamos la cepa de S. cerevisiaeque resulte más interesante, y trabajamos en condiciones de fermentación convencionales. El objetivo es obtener no solo vinos con menor grado alcohólico, sino más diversos en aromas, y que proporcionen un mayor grado de complejidad. No se trata de desalcoholizar el vino, sino de bajar entre uno y tres grados, disminuyendo así los efectos negativos que el alcohol tiene sobre el paladar y la salud (González et al., 2013; Morales et al., 2015). Un resumen de este trabajo se puede encontrar en Acenologia 27.5.2015).

Las fermentaciones mixtas esconden interesantes sorpresas
Por otro lado, el uso de cultivos mixtos de levaduras supone un nuevo reto desde el punto de vista científico, el de entender qué es lo que está ocurriendo en estas poblaciones de levaduras en las que encontramos de forma abundante más de una especie. En este sentido, nuestro grupo lleva un tiempo estudiando cuál es el efecto que el cocultivo produce sobre el comportamiento de las levaduras en el mosto.
Ya se sabía que existen diversos tipos de interacciones entre levaduras (Wang et al. 2015, 2016), generalmente afectando de forma negativa a las no-Saccharomyces, que normalmente desaparecen de la fermentación y son desplazadas por S. cerevisiae. Este desplazamiento se debe en parte a que posee una mayor capacidad fermentativa y de consumo de azúcares, y en parte a su capacidad de tolerar mayores concentraciones de alcohol. Ahora también se sabe que, además de los conocidos factores killer de S. cerevisiae, esta levadura tiene otras estrategias para imponerse en la fermentación, como la producción de pequeños péptidos, derivados de enzimas (con una actividad descrita muy diferente) que poseen actividad antimicrobiana contra diversas especies de levaduras y bacterias.
En nuestro grupo hemos observado, mediante la monitorización de cultivos mixtos de T. delbrueckii y S. cerevisiae, que existía un aumento anormal de la producción de CO2 tras el arranque de la fermentación. Para entenderlo mejor utilizamos la secuenciación de nueva generación (NGS), aprovechando también la reciente publicación del genoma de T. delbrueckii, para hacer un estudio de la reconfiguración transcripcional que ocurría cuando S. cerevisiae y T. delbrueckii arrancaban una fermentación en cocultivo, comparado con el arranque en solitario.
«Hay que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación... aportando un perfil aromático diferente.».
 
Los resultados de este estudio transcriptómico demostraron que T. delbrueckii inducía en S. cerevisiaeun aumento de la expresión de los genes relacionados con la fermentación de azucares (ruta de glucofermentación) y que este efecto también ocurría a la inversa en T. delbrueckii al crecer con S. cerevisiae(Tronchoni et al. 2017). Por tanto, el hecho de tener un importante competidor en el entorno como es T. delbrueckii, una especie de levadura que ha demostrado tener buenas características fermentativas, produce en S. cerevisiae una aceleración del metabolismo, probablemente debido a la competición por nutrientes. Habría que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación, así como su eficiencia. Además, aporta un perfil aromático diferente.
Hemos estudiado otras especies de no-Saccharomyces y hemos visto que el resultado es similar pero no igual, siendo de momento esta cepa de T. delbrueckii la que más acelera el metabolismo de S. cerevisiae. Es posible que no se trate de un resultado con el que se pueda generalizar y que diferentes composiciones de microorganismos, promuevan diferentes resultados, debido a las condiciones en las que se establecen estas interacciones entre las dos levaduras.

Puntos críticos susceptibles de mejora
El empleo de no-Saccharomyces como cultivos iniciadores en enología tiene una serie de problemas que necesitan mejorar, o aspectos que no son lo eficientes que sería deseable. El primer problema que puede encontrar un enólogo que se interese por alguna cepa de no-Saccharomyces es la accesibilidad a estas cepas. A pesar de que el mercado evoluciona rápidamente, y cada año aparecen más cepas en las colecciones de las diferentes empresas, es tan alta la diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, que resulta imposible para las empresas actualizarse al mismo ritmo. Además, como hemos comentado antes, no siempre es una tarea fácil conseguir condiciones de producción eficientes para estas no-Saccharomyces. Aunque exista la opción de encargar estas cepas a pequeñas empresas o centros de investigación, para disponer de un producto único, se trata de una opción costosa.
«La diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, es muy alta.»
 
El control de la imposición y el seguimiento de la fermentación puede ser otro de los principales problemas. Estas cepas no tienen la capacidad fermentativa de S. cerevisiae y, por tanto, su imposición va a ser más problemática que en el caso de la levadura estándar. Al mismo tiempo, será conveniente un seguimiento microbiológico de la situación de la levadura en la fermentación. Dependiendo de las características de la no-Saccharomyces seleccionada, el seguimiento podrá ser más sencillo o más complicado. Desde recuentos en placas en diferentes condiciones (medios de cultivo o temperaturas) que permitan discernir entre una u otra levadura, hasta métodos de identificación moleculares (RFLP, elementos delta, SNP, etc.). Cualquiera de las opciones requiere disponer de laboratorio equipado para análisis microbiológicos y de microbiología molecular, o externalizar los análisis.
Respecto a la imposición, cabe destacar que una de las razones por las que S. cerevisiae se impone con mayor facilidad en las fermentaciones es porque años de domesticación por parte de los bodegueros han seleccionado levaduras que son capaces de resistir un potente agente antimicrobiano, el anhídrido sulfuroso; agente al que la mayoría de las cepas de no-Saccharomyces son sensibles. Será necesario adaptar el sulfitado si decidimos usar estas especies. De hecho, el uso de no-Saccharomyces se ha propuesto también como apoyo a la elaboración de vino sin sulfuroso. Igualmente, como se ha indicado antes, es necesario adaptar la pauta de adición de nutrientes de fermentación, para evitar paradas de fermentación en la segunda etapa de fermentaciones secuenciales.
En general, los criterios de selección de cepas de levaduras no-Saccharomyces para el desarrollo de estos nuevos cultivos iniciadores se basan en su comportamiento en cultivos puros, ya sea en medios sintéticos o en mostos naturales. Estos estudios, que son necesarios en una primera fase de cualquier proceso de selección, permiten obtener una primera impresión de las potencialidades de las levaduras. Sin embargo, en condiciones reales de utilización, incluso aunque se trate de inoculación secuencial, se van a producir interacciones entre las diferentes levaduras implicadas. Algunos ejemplos de estas interacciones se han descrito antes.
Estas interacciones no solo afectan a la dinámica de poblaciones, sino a los metabolitos que se producen. Y tampoco son unidireccionales, sino que tanto S. cerevisiae como las no-Saccharomyces pueden modificar su perfil metabólico cuando participan en la misma fermentación. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta estas posibilidades en el desarrollo de nuevas levaduras comerciales, así como conocer la compatibilidad entre cepas o especies de levaduras, o al menos cuáles son las consecuencias de su utilización conjunta, más allá de las potencialidades que se aprecian cuando se utilizan por separado.

Conclusión
El empleo de las no-Saccharomyces se está extendiendo, en parte gracias a que responde a una de las demandas del mercado, la de disponer de productos con un perfil y una imagen más “natural” o tradicional, y más parecidos a los derivados de fermentaciones espontáneas. Además, el empleo de estas no-Saccharomyces abre todo un abanico de posibilidades de mejora del vino, tanto en los aspectos mencionados aquí (aroma, acidez, glicerol, manoproteínas, color o grado alcohólico), como en otros que revelen en el futuro, ya que, debido a su potencial, son muchos los grupos de investigación trabajando con estas levaduras.
Tal como hemos visto en nuestro grupo de investigación, hay indicios de que el empleo de mezclas de levadura como cultivos iniciadores puede suponer más ventajas de las que a priori se pensaba, al conseguir arranques de fermentación más sólidos y eficientes. En cualquier caso, el estudio de las interacciones entre los cultivos iniciadores utilizados en la misma fermentación va a ser crucial para mejorar el control de la fermentación en estas nuevas condiciones.

Agradecimientos
El trabajo en nuestro grupo está financiado por los proyectos MINECO/FEDER RTC-2014-2186-2 y AGL2015-63629-R (MINECO/FEDER, UE); y el proyecto de la UE YeSVitE (7FP-IRSES-GA n.° 612441).

Bibliografía
Gamero A, Tronchoni J, Querol A, Belloch C. Production of aroma compounds by cryotolerant Saccharomyces species and hybrids at low and moderate fermentation temperatures. J Appl Microbiol 2013; 114: 1405-14. 
Gonzalez R, Quirós M, Morales P. Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: a promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends Food Sci Tech 2013; 29: 55-61.
Medina-Trujillo L, Gonzalez-Royo E, Sieczkowski N, Heras J, Canals JM, Zamora F. Effect of sequential inoculation (Torulaspora delbrueckii/Saccahromyces cerevisiae) in the first fermentation on foaming properties of sparkling wine. Eur Food Res Technol2017; 243: 681-8.
Morales P, Rojas V, Quirós M, Gonzalez R. The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture. Appl Microbiol Biotechnol 2015; 99: 3993-4003.
Tronchoni J, Curiel JA, Morales P, Torres-Perez R, Gonzalez R. Early transcriptional response to biotic stress in mixed starter fermentations involving Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii. Int J Food Microbiol 2017; 241: 60-8. 
Wang C, Mas A, Esteve-Zarzoso B. Interaction between Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae during alcoholic fermentation. Int J Food Microbiol 2015; 206: 67-74. 
Wang C, Mas A, Esteve-Zarzoso B. The Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Non-Saccharomyces Yeast during Alcoholic Fermentation Is Species and Strain Specific. Front Microbiol 2016; 7: 502. 

15/1/18

Innovaciones en enología


Fernando Zamora Departamento de Bioquímica y Biotecnología
Facultad de Enología. Universitat Rovira i Virgili
Tarragona
www.fe.urv.cat
Es evidente que la enología es una ciencia viva que evoluciona y se actualiza constantemente debido en parte a las necesidades de mejorar y optimizar los procesos y la calidad del producto, así como por la obligación de adaptarse a las necesidades de un mercado cambiante y a unas condiciones climáticas cada vez más complicadas por el calentamiento global.La ciencia y la tecnología disponibles en la actualidad permiten aplicar procesos inimaginables tan solo hace unos años y, por ello, los enólogos deben reciclarse constantemente con el fin de estar al día de las diferentes posibilidades tecnológicas que hay a su alcance. En este contexto, el presente monográfico trata de «Innovaciones en enología» con el objetivo de poner de relieve la actualidad en algunos de los aspectos más novedosos e interesantes.
«¿Quién no ha participado en pruebas con Torulaspora, Pichia o Metschnikowia en alguna de las últimas vendimias?».
Es indudable que el uso de levaduras no-Saccharomyces es uno de los temas más de moda de los últimos años. ¿Quién no ha participado en pruebas con TorulasporaPichia o Metschnikowiaen alguna de las últimas vendimias? La razón es bien simple, con el uso de levaduras no-Saccharomyces queremos obtener las ventajas y la complejidad de las fermentaciones espontáneas sin sus riesgos e inconvenientes. En este monográfico, el primer artículo firmado por Jordi Tronchoni, Pilar Morales y Ramón González, del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino de La Rioja, cuyo título es «Aplicación de levaduras no-Saccharomyces en enología», se realiza una síntesis de los conocimientos actuales sobre este tema y se recapitula sobre las distintas especies de levaduras no-Saccharomyces presentes en el mercado; las ventajas específicas que podemos obtener con su utilización y las perspectivas de futuros que podemos esperar en los próximos años.
Los métodos analíticos son una herramienta imprescindible para poder controlar el proceso de vinificación y obtener información sobre las características de nuestros vinos. Es también un hecho indiscutible que la química analítica del vino ha experimentado avances espectaculares durante los últimos años, no tan solo en el desarrollo de nuevos métodos analíticos sino también en su simplificación, con el fin de poderlos utilizar de forma ágil y sencilla en las bodegas. De hecho, la presencia de equipos analíticos como FTIRS, autoanalizadores o biosensores en las bodegas ha crecido significativamente en los últimos tiempos.
Precisamente sobre la aplicación de los biosensores en el análisis enológico trata Asier Albizu de la empresa Biolan. En este segundo artículo, «Biosensores, actores de la revolución 4.0» nos presenta las bases de funcionamiento de los biosensores, sus aplicaciones actuales en enología y las perspectivas de futuro de estas herramientas analíticas.
Entre las nuevas tecnologías que se aplican en vinificación, aquellas que van dirigidas a mejorar la extracción del color y de los componentes fenólicos de la uva tinta representan uno de los puntos que más interesan al enólogo. Eso es tan cierto, que muchas bodegas se han provisto en los últimos años de equipos para realizar termovinificaciones, Flash-détente, cubas automáticas o equipos para enfriar la vendimia con CO2 líquido, entre otros.
El tercer artículo del monográfico va a cargo de Ana Belén Bautista-Ortín, Ricardo Jurado, Juan Alberto Iniesta, María Dolores Jiménez Martínez y Encarna Gómez-Plaza, de la Universidad de Murcia y de la empresa Agrovin. Con el título de «Aplicación de ultrasonidos de alta potencia para acortar el tiempo de maceración de los vinos tintos», trata de la aplicación de una innovadora técnica que permite mejorar la extracción del color y que sin duda tiene unas inmejorables perspectivas de futuro.
La estabilización proteica de los vinos blancos aún es un tema no resuelto totalmente. Alcanzar la estabilidad proteica es muy sencillo pero, a veces, implica utilizar dosis de bentonita muy elevadas, especialmente en ciertas variedades como sauvignon blanc o verdejo, lo que implica una disminución de la cualidad aromática y de la textura al paladar del vino. Por ello, la investigación ha buscado, y continúa buscando, técnicas alternativas a la clarificación con bentonita. De este tema trata el cuarto artículo de este monográfico, «Nuevas herramientas para la estabilización proteica de los vinos blancos», en el que el Dr. Matteo Maragnon, de la Universidad de Padua (Italia), detalla los mecanismos responsables del enturbiamiento proteico y presenta las posibles técnicas alternativas para la estabilización proteica de los vinos. Sin duda alguna, esta temática despertará el interés de los lectores.
Para concluir, el Dr. Joan Miquel Canals y Fernando Zamora, de la Universitat Rovira i Virgili, presentan el último trabajo de este monográfico, «Innovaciones en la estabilización tartárica del vino», en el que tratamos las alternativas actuales para alcanzar la estabilidad del vino frente a las cristalizaciones de las sales del ácido tartárico. En este artículo se comparan los diferentes procedimientos actuales como el tratamiento por frío, la electrodiálisis o el uso de columnas de intercambio catiónico, con la utilización de coloides protectores como el ácido metatartárico, la carboximetilcelulosa, las manoproteínas y el poliaspartato potásico, recientemente autorizado por la OIV.
Confío que los contenidos descritos sean del interés de los lectores de Acenología, y contribuyan a actualizar sus conocimientos sobre algunos de los avances más significativos en innovación enológica.

8/1/18

Innovaciones en enología


Fernando Zamora Departamento de Bioquímica y Biotecnología
Facultad de Enología. Universitat Rovira i Virgili
Tarragona
www.fe.urv.cat
Es evidente que la enología es una ciencia viva que evoluciona y se actualiza constantemente debido en parte a las necesidades de mejorar y optimizar los procesos y la calidad del producto, así como por la obligación de adaptarse a las necesidades de un mercado cambiante y a unas condiciones climáticas cada vez más complicadas por el calentamiento global.La ciencia y la tecnología disponibles en la actualidad permiten aplicar procesos inimaginables tan solo hace unos años y, por ello, los enólogos deben reciclarse constantemente con el fin de estar al día de las diferentes posibilidades tecnológicas que hay a su alcance. En este contexto, el presente monográfico trata de «Innovaciones en enología» con el objetivo de poner de relieve la actualidad en algunos de los aspectos más novedosos e interesantes.
«¿Quién no ha participado en pruebas con Torulaspora, Pichia o Metschnikowia en alguna de las últimas vendimias?».
 
Es indudable que el uso de levaduras no-Saccharomyces es uno de los temas más de moda de los últimos años. ¿Quién no ha participado en pruebas con TorulasporaPichia o Metschnikowiaen alguna de las últimas vendimias? La razón es bien simple, con el uso de levaduras no-Saccharomyces queremos obtener las ventajas y la complejidad de las fermentaciones espontáneas sin sus riesgos e inconvenientes. En este monográfico, el primer artículo firmado por Jordi Tronchoni, Pilar Morales y Ramón González, del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino de La Rioja, cuyo título es «Aplicación de levaduras no-Saccharomyces en enología», se realiza una síntesis de los conocimientos actuales sobre este tema y se recapitula sobre las distintas especies de levaduras no-Saccharomyces presentes en el mercado; las ventajas específicas que podemos obtener con su utilización y las perspectivas de futuros que podemos esperar en los próximos años.
Los métodos analíticos son una herramienta imprescindible para poder controlar el proceso de vinificación y obtener información sobre las características de nuestros vinos. Es también un hecho indiscutible que la química analítica del vino ha experimentado avances espectaculares durante los últimos años, no tan solo en el desarrollo de nuevos métodos analíticos sino también en su simplificación, con el fin de poderlos utilizar de forma ágil y sencilla en las bodegas. De hecho, la presencia de equipos analíticos como FTIRS, autoanalizadores o biosensores en las bodegas ha crecido significativamente en los últimos tiempos.
Precisamente sobre la aplicación de los biosensores en el análisis enológico trata Asier Albizu de la empresa Biolan. En este segundo artículo, «Biosensores, actores de la revolución 4.0» nos presenta las bases de funcionamiento de los biosensores, sus aplicaciones actuales en enología y las perspectivas de futuro de estas herramientas analíticas.
Entre las nuevas tecnologías que se aplican en vinificación, aquellas que van dirigidas a mejorar la extracción del color y de los componentes fenólicos de la uva tinta representan uno de los puntos que más interesan al enólogo. Eso es tan cierto, que muchas bodegas se han provisto en los últimos años de equipos para realizar termovinificaciones, Flash-détente, cubas automáticas o equipos para enfriar la vendimia con CO2 líquido, entre otros.
El tercer artículo del monográfico va a cargo de Ana Belén Bautista-Ortín, Ricardo Jurado, Juan Alberto Iniesta, María Dolores Jiménez Martínez y Encarna Gómez-Plaza, de la Universidad de Murcia y de la empresa Agrovin. Con el título de «Aplicación de ultrasonidos de alta potencia para acortar el tiempo de maceración de los vinos tintos», trata de la aplicación de una innovadora técnica que permite mejorar la extracción del color y que sin duda tiene unas inmejorables perspectivas de futuro.
La estabilización proteica de los vinos blancos aún es un tema no resuelto totalmente. Alcanzar la estabilidad proteica es muy sencillo pero, a veces, implica utilizar dosis de bentonita muy elevadas, especialmente en ciertas variedades como sauvignon blanc o verdejo, lo que implica una disminución de la cualidad aromática y de la textura al paladar del vino. Por ello, la investigación ha buscado, y continúa buscando, técnicas alternativas a la clarificación con bentonita. De este tema trata el cuarto artículo de este monográfico, «Nuevas herramientas para la estabilización proteica de los vinos blancos», en el que el Dr. Matteo Maragnon, de la Universidad de Padua (Italia), detalla los mecanismos responsables del enturbiamiento proteico y presenta las posibles técnicas alternativas para la estabilización proteica de los vinos. Sin duda alguna, esta temática despertará el interés de los lectores.
Para concluir, el Dr. Joan Miquel Canals y Fernando Zamora, de la Universitat Rovira i Virgili, presentan el último trabajo de este monográfico, «Innovaciones en la estabilización tartárica del vino», en el que tratamos las alternativas actuales para alcanzar la estabilidad del vino frente a las cristalizaciones de las sales del ácido tartárico. En este artículo se comparan los diferentes procedimientos actuales como el tratamiento por frío, la electrodiálisis o el uso de columnas de intercambio catiónico, con la utilización de coloides protectores como el ácido metatartárico, la carboximetilcelulosa, las manoproteínas y el poliaspartato potásico, recientemente autorizado por la OIV.
Confío que los contenidos descritos sean del interés de los lectores de Acenología, y contribuyan a actualizar sus conocimientos sobre algunos de los avances más significativos en innovación enológica.

2/1/18

Aplicación de levaduras no-Saccharomyces en enología


Jordi Tronchoni, Pilar Morales y Ramon González Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (CSIC-UR-CAR)
Finca La Grajera
Logroño, La Rioja
Las no-Saccharomyces en enología
En enología, el término no-Saccharomyces engloba a todas aquellas levaduras de diferentes géneros que están presentes en el mosto durante las primeras fases de la fermentación, antes de que Saccharomyces cerevisiae las desplace, siendo esta última especie la que se encuentra mayoritariamente al final de la fermentación. El término no-Saccharomyces ha pasado de emplearse casi exclusivamente para levaduras que se consideraban como alterantes de la calidad, a estar cada vez más ligado a un grupo de levaduras que pueden contribuir positivamente, al aportar variabilidad y tipicidad, y que constituyen una fuente de innovación enológica.
Disponibilidad de las levaduras no-Saccharomyces
A pesar de que en los últimos años estamos asistiendo a un mayor reconocimiento del papel de estas levaduras en la elaboración del vino, en realidad hace ya casi 15 años que están en el mercado (en 2003 apareció a la venta Torulaspora delbrueckii y Kluyveromyces thermotolerans (ahora Lachancea thermotolerans) en el catálogo de un productor comercial de levaduras.
Inicialmente se pusieron a la venta como cultivos iniciadores mixtos en los que se encontraban estas no-Saccharomyces junto a S. cerevisiae. Con el paso de los años, hemos visto cómo cada vez más empresas ofrecían nuevas especies de levaduras en sus catálogos. Hoy en día, no solo encontramos la posibilidad de adquirirlas a través de diferentes empresas y distribuidores tanto internacionales como nacionales (tabla 1), sino que además existen pequeñas compañías especializadas en la producción de levadura a demanda, que incluyen las no-Saccharomyces en su oferta; y centros de investigación especializados en microbiología del vino que también proporcionan este servicio.
Tabla 1. Algunas especies de levaduras comercializadas como LSA para uso enológico
Cepas comerciales
Atributos por los que se comercializan
Torulaspora delbrueckiiMejorar aroma y complejidad en boca de tintos y blancos
Lachancea thermotoleransProductora de ácido láctico, proporciona redondez y equilibrio ácido al vino
Torulaspora delbrueckii /Saccharomyces cerevisiaeIncrementa la complejidad vínica proporcionando aromas frutales
Metschnikowia pulcherrimaMejora de aromas varietales, así como terpenos y tioles
Metschnikowia fructicolaProtección natural contra la contaminación por microorganismos, permite reducir el uso de sulfuroso
Pichia kluyveriMejora de aromas varietales, así como tioles
Schizosaccharomyces pombePermite la desacidificación maloláctica

Precisamente la elaboración y distribución de estas levaduras como levadura seca activa (LSA) es una de las limitaciones que existen en su producción, ya que diferentes géneros de levaduras requieren diferentes condiciones de producción. Además, el proceso de producción de LSA incluye fases en las que las levaduras son sometidas a un gran estrés, y si bien este proceso ha sido muy optimizado para S. cerevisiae, consiguiendo grandes rendimientos de supervivencia de la levadura tras la rehidratación, no lo está tanto para las no-Saccharomyces. Aun así y siempre que los rendimientos sean aceptables será mucho más práctico proporcionar la levadura en forma de LSA, al ser un formato más estable, duradero y económico, que la levadura fresca, menos estable a pesar de que se consigan mejores viabilidades.
Actualmente, para el uso de estas levaduras como cultivos iniciadores se sigue un procedimiento secuencial, de modo que tras la adición de la no-Saccharomyces se deja fermentar unos días (de dos a cuatro según las diferentes empresas) y se inocula S. cerevisiae, que será la encargada de terminar la fermentación, desplazando casi por completo a las levaduras anteriores. En la inoculación secuencial es necesario agregar nuevas fuentes de nitrógeno en la segunda inoculación para asegurar un correcto crecimiento de S. cerevisiae. Cuando no se realiza esta corrección se suelen observar problemas de imposición para S. cerevisiae, ocasionando paradas o ralentización de la fermentación.

Las levaduras no-Saccharomyces como herramienta de mejora en la fermentación y diversificación del producto
Tal como hemos dicho anteriormente, dentro del término no-Saccharomyces se incluye a un gran número de diferentes géneros y especies de levadura, cada cual con características metabólicas particulares, capaces de aportar su impronta al vino. Es precisamente esta diversidad la que ha permitido usar levaduras no-Saccharomyces como herramientas con las que mejorar la fermentación vínica, proporcionando la posibilidad de crear productos más complejos, que recuperen parte de la originalidad de las fermentaciones espontaneas (cuando éstas acaban bien) y que algunas echan en falta en los vinos fermentados con cepas iniciadoras de S. cerevisiae.
El uso de cultivos iniciadores, que combinen cepas de no-Saccharomyces con cepas de S. cerevisiae, o su uso en inoculación secuencial, se postula como una alternativa a la recuperación de la variabilidad que existe en los cultivos “naturales” durante fermentaciones espontaneas, pero sin los problemas que pueden aparecer en éstos, como pueden ser las paradas de fermentación o la aparición de defectos sensoriales. En la medida en la que se busca imitar en cierta forma una fermentación espontánea, se trata de una tendencia que el consumidor final del vino también puede encontrar atractiva, al combinar la innovación con el respeto a la tradición.
....
«
Figura 1. Aspectos de la calidad del vino que pueden modularse
mediante el uso de levaduras no-Saccharomcyes
Las áreas en las que las levaduras no-Saccharomyces pueden ser interesantes por lo que aportan al vino son varias (fig. 1). Una de las principales es indudablemente el aroma, y también una de las primeras que se han estudiado. En el vino, se consideran aromas primarios aquellos que derivan de las uvas, mientras que los aromas secundarios derivan del metabolismo de las levaduras.
Varios de estos compuestos aromáticos de la uva están presentes en forma de precursores glucosilados que, al no ser volátiles, carecen de aroma, y que pueden ser hidrolizados por el enzima β-glucosidasa, normalmente en combinación con otras glucosidasas, para formar volátiles libres que contribuirán al aroma del vino.
El problema es que tan solo unas pocas cepas de S. cerevisiae poseen en su genoma genes que codifiquen estas funciones. En cambio, varios de los géneros de no-Saccharomyces sí los poseen. Los podemos encontrar, por ejemplo, en especies de los géneros DebaryomycesHansenulaCandidaPichia o Kloeckera. En todas ellas, estas actividades contribuyen a liberar compuestos volátiles que mejoran el aroma y la complejidad de los vinos, partiendo de precursores no aromáticos.
Por ejemplo, en el caso de Debaryomyces, una cepa de Debaryomyces vanriji aislada de uva, en estudios en cocultivo con S. cerevisiae permitió obtener vinos con un incremento en geraniol que se ligó a la acción de la β-D-glucosidasa. En fermentaciones con chardonnay, el cocultivo con la cepa industrial de S. cerevisiae VIN13 de una cepa de Debaryomyces pseudopolymorphus incrementó las concentraciones de citronellol, nerol y geraniol.
También existen ejemplos de aumento de tioles volátiles cuando se usa una cepa de Candida zemplinina, aunque en este caso son otros los enzimas implicados. En algunos casos, estos estudios han dado lugar a la comercialización de cepas que ya se pueden encontrar en el mercado, como es el caso de una cepa de Metchnikovia pulcherrima y otra de Pichia kluyveri, ambas recomendadas por el impacto positivo que tienen sobre la generación de terpenos y tioles (Padilla et al. 2016).
Es importante recordar que existen levaduras dentro del género Saccharomyces, distintas de S. cerevisiae, que también producen estos enzimas (Saccharomyces ludwigiiSaccharomyces pararoseus). No hay que olvidar que, aunque se habla de las no-Saccharomyces como alternativas a S. cerevisiae como cultivos iniciadores, existen grupos de investigación en España que investigan sobre otras levaduras del género Saccharomyces, cuyos estudios muestran que también pueden aportar interesantes características al vino (Gamero et al. 2013).
«En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído.».
 
Los cocultivos de no-Saccharomyces con S. cerevisiaetambién se han usado para controlar la acidez volátil en el vino. En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído, incluso partiendo de mostos botritizados.
A pesar de que el impacto de los cultivos mixtos se ha estudiado principalmente por la capacidad de las no-Saccharomyces para influir sobre la composición aromática, existen numerosos trabajos que ponen el foco sobre otros metabolitos importantes en la fermentación. En el caso del glicerol, se ha visto que cepas de C. zemplinina producen vinos con mayor cantidad de este metabolito o que el cocultivo con cepas de Pichia fermentans o L. thermotolerans producen menos ácido acético y un incremento de la acidez volátil junto al glicerol. Existen también ejemplos de cómo las no-Saccharomyces pueden ser beneficiosas para incrementar la producción de manoproteínas, o actuar positivamente sobre la estabilización del color, incluso en vinos espumosos, mejorando las características de la espuma (Medina-Trujillo et al. 2017).
No-Saccharomyces y vinos con menor grado alcohólico
Recientemente el empleo de las no-Saccharomyces se ha propuesto para disminuir el grado alcohólico. Las diferencias metabólicas que existen entre las no-Saccharomyces y S. cerevisiaehacen que estas levaduras puedan suponer una mejor alternativa al intento de disminuir el grado alcohólico mediante el uso de cepas de S. cerevisiae que tengan una menor producción de etanol. Al fin y al cabo, los fenómenos de domesticación y adaptación a la fermentación alcohólica y la producción de vino de S. cerevisiae, la han convertido en una de las levaduras con mayor eficiencia alcohólica. Siendo por tanto más interesante buscar en la diversidad de las no-Saccharomyces una respuesta a la reciente problemática del aumento del grado alcohólico.
En nuestro grupo hemos desarrollado y optimizado un protocolo para la inoculación secuencial de cepas de levaduras pertenecientes a T. delbrueckii y M. pulcherrima junto a S. cerevisiae para obtener vinos con menor grado alcohólico. Durante los primeros días de fermentación y mediante el uso de aireación, permitimos a las no-Saccharomyces respirar en vez de fermentar los azucares de la uva. Una vez se han consumido parte de estos azúcares, inoculamos la cepa de S. cerevisiaeque resulte más interesante, y trabajamos en condiciones de fermentación convencionales. El objetivo es obtener no solo vinos con menor grado alcohólico, sino más diversos en aromas, y que proporcionen un mayor grado de complejidad. No se trata de desalcoholizar el vino, sino de bajar entre uno y tres grados, disminuyendo así los efectos negativos que el alcohol tiene sobre el paladar y la salud (González et al., 2013; Morales et al., 2015). Un resumen de este trabajo se puede encontrar en Acenologia 27.5.2015).

Las fermentaciones mixtas esconden interesantes sorpresas
Por otro lado, el uso de cultivos mixtos de levaduras supone un nuevo reto desde el punto de vista científico, el de entender qué es lo que está ocurriendo en estas poblaciones de levaduras en las que encontramos de forma abundante más de una especie. En este sentido, nuestro grupo lleva un tiempo estudiando cuál es el efecto que el cocultivo produce sobre el comportamiento de las levaduras en el mosto.
Ya se sabía que existen diversos tipos de interacciones entre levaduras (Wang et al. 2015, 2016), generalmente afectando de forma negativa a las no-Saccharomyces, que normalmente desaparecen de la fermentación y son desplazadas por S. cerevisiae. Este desplazamiento se debe en parte a que posee una mayor capacidad fermentativa y de consumo de azúcares, y en parte a su capacidad de tolerar mayores concentraciones de alcohol. Ahora también se sabe que, además de los conocidos factores killer de S. cerevisiae, esta levadura tiene otras estrategias para imponerse en la fermentación, como la producción de pequeños péptidos, derivados de enzimas (con una actividad descrita muy diferente) que poseen actividad antimicrobiana contra diversas especies de levaduras y bacterias.
En nuestro grupo hemos observado, mediante la monitorización de cultivos mixtos de T. delbrueckii y S. cerevisiae, que existía un aumento anormal de la producción de CO2 tras el arranque de la fermentación. Para entenderlo mejor utilizamos la secuenciación de nueva generación (NGS), aprovechando también la reciente publicación del genoma de T. delbrueckii, para hacer un estudio de la reconfiguración transcripcional que ocurría cuando S. cerevisiae y T. delbrueckii arrancaban una fermentación en cocultivo, comparado con el arranque en solitario.
«Hay que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación... aportando un perfil aromático diferente.».
 
Los resultados de este estudio transcriptómico demostraron que T. delbrueckii inducía en S. cerevisiaeun aumento de la expresión de los genes relacionados con la fermentación de azucares (ruta de glucofermentación) y que este efecto también ocurría a la inversa en T. delbrueckii al crecer con S. cerevisiae(Tronchoni et al. 2017). Por tanto, el hecho de tener un importante competidor en el entorno como es T. delbrueckii, una especie de levadura que ha demostrado tener buenas características fermentativas, produce en S. cerevisiae una aceleración del metabolismo, probablemente debido a la competición por nutrientes. Habría que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación, así como su eficiencia. Además, aporta un perfil aromático diferente.
Hemos estudiado otras especies de no-Saccharomyces y hemos visto que el resultado es similar pero no igual, siendo de momento esta cepa de T. delbrueckii la que más acelera el metabolismo de S. cerevisiae. Es posible que no se trate de un resultado con el que se pueda generalizar y que diferentes composiciones de microorganismos, promuevan diferentes resultados, debido a las condiciones en las que se establecen estas interacciones entre las dos levaduras.

Puntos críticos susceptibles de mejora
El empleo de no-Saccharomyces como cultivos iniciadores en enología tiene una serie de problemas que necesitan mejorar, o aspectos que no son lo eficientes que sería deseable. El primer problema que puede encontrar un enólogo que se interese por alguna cepa de no-Saccharomyces es la accesibilidad a estas cepas. A pesar de que el mercado evoluciona rápidamente, y cada año aparecen más cepas en las colecciones de las diferentes empresas, es tan alta la diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, que resulta imposible para las empresas actualizarse al mismo ritmo. Además, como hemos comentado antes, no siempre es una tarea fácil conseguir condiciones de producción eficientes para estas no-Saccharomyces. Aunque exista la opción de encargar estas cepas a pequeñas empresas o centros de investigación, para disponer de un producto único, se trata de una opción costosa.
«La diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, es muy alta.»
 
El control de la imposición y el seguimiento de la fermentación puede ser otro de los principales problemas. Estas cepas no tienen la capacidad fermentativa de S. cerevisiae y, por tanto, su imposición va a ser más problemática que en el caso de la levadura estándar. Al mismo tiempo, será conveniente un seguimiento microbiológico de la situación de la levadura en la fermentación. Dependiendo de las características de la no-Saccharomyces seleccionada, el seguimiento podrá ser más sencillo o más complicado. Desde recuentos en placas en diferentes condiciones (medios de cultivo o temperaturas) que permitan discernir entre una u otra levadura, hasta métodos de identificación moleculares (RFLP, elementos delta, SNP, etc.). Cualquiera de las opciones requiere disponer de laboratorio equipado para análisis microbiológicos y de microbiología molecular, o externalizar los análisis.
Respecto a la imposición, cabe destacar que una de las razones por las que S. cerevisiae se impone con mayor facilidad en las fermentaciones es porque años de domesticación por parte de los bodegueros han seleccionado levaduras que son capaces de resistir un potente agente antimicrobiano, el anhídrido sulfuroso; agente al que la mayoría de las cepas de no-Saccharomyces son sensibles. Será necesario adaptar el sulfitado si decidimos usar estas especies. De hecho, el uso de no-Saccharomyces se ha propuesto también como apoyo a la elaboración de vino sin sulfuroso. Igualmente, como se ha indicado antes, es necesario adaptar la pauta de adición de nutrientes de fermentación, para evitar paradas de fermentación en la segunda etapa de fermentaciones secuenciales.
En general, los criterios de selección de cepas de levaduras no-Saccharomyces para el desarrollo de estos nuevos cultivos iniciadores se basan en su comportamiento en cultivos puros, ya sea en medios sintéticos o en mostos naturales. Estos estudios, que son necesarios en una primera fase de cualquier proceso de selección, permiten obtener una primera impresión de las potencialidades de las levaduras. Sin embargo, en condiciones reales de utilización, incluso aunque se trate de inoculación secuencial, se van a producir interacciones entre las diferentes levaduras implicadas. Algunos ejemplos de estas interacciones se han descrito antes.
Estas interacciones no solo afectan a la dinámica de poblaciones, sino a los metabolitos que se producen. Y tampoco son unidireccionales, sino que tanto S. cerevisiae como las no-Saccharomyces pueden modificar su perfil metabólico cuando participan en la misma fermentación. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta estas posibilidades en el desarrollo de nuevas levaduras comerciales, así como conocer la compatibilidad entre cepas o especies de levaduras, o al menos cuáles son las consecuencias de su utilización conjunta, más allá de las potencialidades que se aprecian cuando se utilizan por separado.

Conclusión
El empleo de las no-Saccharomyces se está extendiendo, en parte gracias a que responde a una de las demandas del mercado, la de disponer de productos con un perfil y una imagen más “natural” o tradicional, y más parecidos a los derivados de fermentaciones espontáneas. Además, el empleo de estas no-Saccharomyces abre todo un abanico de posibilidades de mejora del vino, tanto en los aspectos mencionados aquí (aroma, acidez, glicerol, manoproteínas, color o grado alcohólico), como en otros que revelen en el futuro, ya que, debido a su potencial, son muchos los grupos de investigación trabajando con estas levaduras.
Tal como hemos visto en nuestro grupo de investigación, hay indicios de que el empleo de mezclas de levadura como cultivos iniciadores puede suponer más ventajas de las que a priori se pensaba, al conseguir arranques de fermentación más sólidos y eficientes. En cualquier caso, el estudio de las interacciones entre los cultivos iniciadores utilizados en la misma fermentación va a ser crucial para mejorar el control de la fermentación en estas nuevas condiciones.

Agradecimientos
El trabajo en nuestro grupo está financiado por los proyectos MINECO/FEDER RTC-2014-2186-2 y AGL2015-63629-R (MINECO/FEDER, UE); y el proyecto de la UE YeSVitE (7FP-IRSES-GA n.° 612441).

Bibliografía
Gamero A, Tronchoni J, Querol A, Belloch C. Production of aroma compounds by cryotolerant Saccharomyces species and hybrids at low and moderate fermentation temperatures. J Appl Microbiol 2013; 114: 1405-14. 
Gonzalez R, Quirós M, Morales P. Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: a promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends Food Sci Tech 2013; 29: 55-61.
Medina-Trujillo L, Gonzalez-Royo E, Sieczkowski N, Heras J, Canals JM, Zamora F. Effect of sequential inoculation (Torulaspora delbrueckii/Saccahromyces cerevisiae) in the first fermentation on foaming properties of sparkling wine. Eur Food Res Technol2017; 243: 681-8.
Morales P, Rojas V, Quirós M, Gonzalez R. The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture. Appl Microbiol Biotechnol 2015; 99: 3993-4003.
Tronchoni J, Curiel JA, Morales P, Torres-Perez R, Gonzalez R. Early transcriptional response to biotic stress in mixed starter fermentations involving Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii. Int J Food Microbiol 2017; 241: 60-8. 
Wang C, Mas A, Esteve-Zarzoso B. Interaction between Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae during alcoholic fermentation. Int J Food Microbiol 2015; 206: 67-74. 
Wang C, Mas A, Esteve-Zarzoso B. The Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Non-Saccharomyces Yeast during Alcoholic Fermentation Is Species and Strain Specific. Front Microbiol 2016; 7: 502.