1/4/20

Medio Ambiente

RESIDUOS DE LA PODA VERDE, EN EL MOMENTO ADECUADO PARA SU VALORIZACIÓN

La vastísima extensión dedicada al cultivo de la vid y el enorme volumen de la producción mundial de uva generan una cantidad de residuos con un elevado impacto medioambiental y económico. La aprobación de diversas directrices por organismos reguladores como la propia Comisión Europea imprime una urgencia adicional a la búsqueda de soluciones para estos residuos. Una opción que gana interés es la explotación de los subproductos de la viticultura como fuentes renovables de nutrientes y de compuestos bioactivos para la industria alimentaria para humanos y animales. Entre estos subproductos se encuentran los residuos de la poda verde (GPR) y las hojas de vid, especialmente interesantes por la cantidad de antioxidantes que contienen. Pero el problema con estas últimas es que se suelen recoger tras la aplicación de pesticidas, lo cual dificulta su uso posterior en alimentación. Por ello, este estudio presta especial atención a los restos de la poda verde en primavera, antes de la aplicación de pesticidas, y se estudia su potencial uso como fuente de antioxidantes. Los autores del estudio extrajeron los compuestos fenólicos con ultrasonidos, una técnica fácil de aplicar y de elevado rendimiento. La conclusión es que la valorización de estos residuos de poda da lugar a una interesante fuente de compuestos naturales que podrían ser utilizados en distintos sectores, lo que aumentaría su valor económico y ejercería un efecto positivo sobre el medio ambiente.

Acquadro, S.; Appleton, S.; Marengo, A.; Bicchi, C.; Sgorbini, B.; Mandrone, M.; Gai, F.; Peiretti, P.G.; Cagliero, C y Rubiolo, P.: “Grapevine Green Pruning Residues as a Promising and Sustainable Source of Bioactive Phenolic Compounds”, ”Molecules ; 2020, 25 (3): 464.

26/3/20

Medio Ambiente

REGISTROS DE 600 AÑOS DE VITICULTURA EN BORGOÑA CERTIFICAN LA EMERGENCIA CLIMÁTICA

En las últimas semanas se ha hecho énfasis sobre la emergencia climática, a raíz de la cumbre sobre el clima COP25 celebrada en Madrid a principios de diciembre y en la que la industria del vino ha tenido un papel significativo. La uva es un cultivo muy sensible al clima. El equilibrio es tan delicado que su cultivo se reduce a zonas muy específicas que, a lo largo de los siglos, se han ido concentrando en áreas con temperaturas promedio de entre 12 y 22ºC, en las latitudes entre los 30º y los 50º. Algunas previsiones afirman que la frontera norte del cultivo de la vid en Europa podría avanzar entre 20 y 60 kilómetros cada década. Unos meses atrás se publicaba un artículo que recogía más de 600 años de datos de Borgoña, en los que se ve el inexorable efecto del cambio climático. Las uvas de vino europeas están madurando antes de lo usual, según registros de siglos de viñedos de esta icónica región francesa, que en la ciudad de Beaune se remontan a 1384. Autores de la Universidad de Borgoña en Dijon examinaron registros originales y los contrastaron con otros datos de cosechas en Borgoña también desde el s. XIV hasta la actualidad (1354-2018, la serie continua más larga de datos estacionales en Europa). El análisis de este conjunto de datos revela que las cosechas tempranas en veranos muy calurosos no eran desconocidas, pero sí muy infrecuentes, y ahora se han convertido en la norma, en especial desde la década de 1980. Durante más de 630 años (1354 a 1987), la cosecha se efectuaba en promedio a finales de septiembre (después del 28). A partir de 1988, período de calentamiento rápido, dicho promedio se adelanta 13 días (15 de septiembre).

Labbé, T.; Pfister, C.; Brönnimann, S.; Rousseau, D.; Franke, J. y Bois, B.: “The longest homogeneous series of grape harvest dates, Beaune 1354–2018, and its significance for the understanding of past and present climate”, ” Climate of the Past ; 2019, 15: 1485–1501. doi.org/10.5194/cp-15-1485-2019.

19/3/20

COEXISTENCIA DE LEVADURAS Y BACTERIAS LÁCTICAS INOCULADAS Y SU IMPACTO EN EL PERFIL AROMÁTICO DEL VINO TINTO TEMPRANILLO

Este estudio investiga los efectos de la inoculación simultánea de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae seleccionada con dos cepas comerciales diferentes de la bacteria del vino Oenococcus oeni al inicio de la fermentación alcohólica sobre la cinética de la fermentación maloláctica (FML), la composición química del vino y las características organolépticas, en comparación con la FML espontánea en mosto de uva tempranillo de Castilla-La Mancha (España). El seguimiento de la evolución de la FML se llevó a cabo mediante el análisis periódico de ácido L-málico a través del método enzimático, y los parámetros fisicoquímicos y características sensoriales más comunes se evaluaron mediante un análisis sensorial estandarizado. Las muestras se analizaron por GC / MS. La coinoculación redujo el tiempo total de fermentación en hasta dos semanas, lo que condujo a un menor incremento de la acidez volátil. El perfil de volátiles derivado de la fermentación fue distinto entre los vinos coinoculados y la FML espontánea, influenciado por las bacterias enológicas seleccionadas utilizadas en la coinoculación. La coinoculación permite que la FML se desarrolle en condiciones reductoras y da como resultado vinos con muy pocos sabores lácticos y mantecosos relacionados con el impacto de compuestos específicos como el 2,3-butanodiona. También se ha confirmado que este compuesto tiene estrecha relación con la cepa de bacteria enológica utilizada.

Izquierdo-Cañas, P.M.; Ríos-Carrasco, M.; García-Romero, E.; Mena-Morales, A.; Heras-Manso, J.M.; Cordero –Bueso, G.: “Co-existence of Inoculated Yeast and Lactic Acid Bacteria and Their Impact on the Aroma Profile and Sensory Traits of Tempranillo Red Wine”, ”Fermentation ; 2020, 6(1): 17. Doi.org/ 10.3390/fermentation6010017.

12/3/20

Dotación sensorial

DESENTRAÑANDO LAS COMPLEJIDADES AROMÁTICAS DEL VINO

La idea de que el aroma del vino es indescifrable podría estar empezando a cuestionarse a causa de este artículo que comentamos. Si bien no deja de ser cierto que la cantidad de diferentes odorantes presentes en el vino es enorme y sus interacciones perceptivas son muy complejas, la mayoría de estudios anteriores estudiaban sus interacciones que no eran los normales de concentración en el vino real. Los autores, de la Universidad de Zaragoza y la Universidad de la Borgoña Franche-Comté, han estudiado la contribución del aroma de 14 ésteres etílicos individuales en mezclas complejas que imitan los modelos de vino tinto. Prepararon simulaciones con un número reducido de ésteres que introdujeron en vinos para evaluar si podrían reemplazar a los naturales sin afectar a la calidad del vino. La sorprendente conclusión es que los 14 ésteres etílicos diferentes que se encuentran naturalmente en los vinos pueden ser reemplazados solo por 3 o incluso 1 de los ésteres etílicos, sin notar cambio alguno cualitativo. Ello implica que muchos compuestos aromáticos ligeramente diferentes que muestran olores relativamente similares, actúan juntos de manera concertada y que por tanto el aroma del vino se puede descifrar identificando el número limitado de vectores de aroma activos que contiene. Es un resultado relevante para la industria del sabor.

De la Fuente Blanco, A.; Sáenz Navajas, M.P., Valentin, D. y Ferreira, V.: “Fourteen ethyl esters of wine can be replaced by simpler ester vectors without compromising quality but at the expense of increasing aroma concentration”, ” Food Chemistry ; 2020, 307: 125553.

5/3/20

Fermentación maloláctica

MEDIDAS PARA MEJORAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA

Revisión firmada en la Universidad de Adelaida, en Australia, que analiza los trabajos realizados para mejorar la eficiencia y la fiabilidad de la fermentación maloláctica (FML). Es bien sabida la importancia de la FML en la composición del vino. Esta reacción no es sólo la descarboxilación simple del ácido L-málico en ácido L-láctico y CO2. Las bacterias responsables de esta transformación consumen componentes del vino, lo que significa que producirán ciertos compuestos que influirán en la dotación aromática propia de la uva y también en los derivados de la fermentación alcohólica, proporcionando además estabilidad al producto final. La práctica vinícola utiliza tales capacidades de las bacterias malolácticas para modular la calidad final del producto, en función de la zona geográfica y de la necesidad de reducir aspectos como la acidez del vino, entre otros parámetros. Por tanto, existe numerosa bibliografía sobre el uso y las potencialidades de la FML, y también sobre problemas derivados de esta. El trabajo que comentamos pone de relieve que una FML fiable es clave para conseguir un proceso de vinificación eficiente y sin afectaciones en el producto final. Los autores revisan los problemas que puede presentar esta reacción, y qué técnicas favorecen su éxito, ya sea por adecuada selección de cepas, inoculación o seguimiento de la reacción, sugiriendo futuras líneas de investigación en este campo.

Sumby, K.M.; Bartle, L.; Grbin, P.R. y Jiranek, V.: “Measures to improve wine malolactic fermentation”, ” Applied Microbiology and Biotechnology ; 2019, 103 (5): 2033-2051. doi: 10.1007/s00253-018-09608-8.

2/3/20

Estrategias para el desarrollo de la fermentación maloláctica en vinos con pH extremos

Carmen Berbegal, Isabel Pardo y Sergi FerrerENOLAB. BioTecMed. Universitat de València
Campus de Burjassot, Valencia.
Introducción
Por diversas causas entre las que destacan los efectos del cambio climático, en los últimos años la industria enológica ha sufrido una transformación importante, convirtiéndose en un sector de constantes cambios e innovaciones. Las dificultades para llevar a cabo la fermentación maloláctica (FML) por parte de las bacterias lácticas (BL) han promovido el estudio, desarrollo y mejora de diferentes tecnologías para llevar a cabo este proceso con éxito. El control eficiente de la FML requiere un amplio conocimiento de la respuesta de las BL a las actuales condiciones de estrés que se encuentran en el mosto y en el vino.1
La capacidad de las BL para realizar la FML está influenciada por muchos factores entre los que se incluyen el pH, la temperatura, el contenido de inhibidores del crecimiento (etanol, SO2, ácidos grasos de cadena media, etc.), la escasez de nutrientes, las cepas de levadura que realizan la fermentación alcohólica (FA) y las diferentes interacciones entre las especies que forman la microbiota autóctona.2,4 La supervivencia de las bacterias malolácticas en el vino bajo tales condiciones de estrés requiere el mantenimiento de la funcionalidad de la membrana celular para poder controlar la permeabilidad iónica y regular el intercambio de solutos y nutrientes entre el interior celular y el medio externo.1 Entre los factores de estrés mencionados, el etanol se considera el más decisivo porque daña la membrana celular afectando gravemente a su integridad y por tanto a la viabilidad bacteriana.5 Tras el etanol, el segundo factor de estrés más importante que afecta a las BL durante el proceso de vinificación es el pH.1
El cambio climático modifica el desarrollo de la vid y los perfiles de maduración del fruto. El aumento de la temperatura ambiente afecta a la acidez total, el pH de los mostos y una alta concentración de azúcar de los mostos, lo que implica vinos de baja acidez, y valores de pH y etanol altos debido a la sobremaduración.6,7 La mayoría de los vinos tienen un pH que oscila entre 3,2 y 3,8, pero puede llegarse fácilmente hoy en día a valores inferiores a 3,0 o superiores a 4,0.8-11 Por debajo de 3,2, en vinos muy ácidos, la FML es particularmente difícil debido a dos factores principales: por un lado, el estrés que supone el propio valor de pH en sí mismo y las dificultades que implica para un mantenimiento adecuado del intracelular de las bacterias; por otro, porque supone un efecto sinérgico negativo con otros factores, especialmente el sulfuroso (mayor cantidad de SO2 libre y molecular a pH bajos). Sin embargo, cuanto mayor es el pH, la realización de la FML es más fácil, pero el inconveniente radica en que mayor variedad de bacterias serán capaces de desarrollarse, ya que más favorables son las condiciones para el crecimiento bacteriano y la consiguiente posible alteración de los mostos y vinos.
«En la actualidad, los vinos con baja acidez total y elevado pH son cada vez más frecuentes debido al cambio climático.».
Aunque Oenococcus oeni se ha considerado la especie predominante durante la FML espontánea, no es la única. Los vinos con un pH próximo a 4,0 permiten el desarrollo de BL y bacterias y levaduras no deseadas, así como la formación de compuestos tóxicos como aminas biógenas.2,12,13 En la actualidad, los vinos con baja acidez total y elevado pH son cada vez más frecuentes debido al cambio climático. En el otro extremo, el uso cada vez mayor de variedades de uva de bajo pH en la vinificación y el interés en la realización de la FML en vinos blancos y espumosos hace que encontremos vinos de pH bajo en los que es muy difícil llevar a cabo la FML. En ambos casos es necesario un control muy exhaustivo de la microbiota que realizará la fermentación y la elección correcta de la estrategia de inoculación.
Esta revisión se centra en resumir una considerable cantidad de investigación que se ha dirigido en los últimos años hacia la mejora de la eficiencia y la fiabilidad de la FML en condiciones difíciles, especialmente en vinos que presentan niveles de pH extremos, muy altos o muy bajos. Se discuten los impedimentos para el desarrollo de la FML y se presta atención a cómo mejorar el éxito de la misma a través de diferentes estrategias de inoculación y mediante el uso de diferentes especies microbianas. También se proporciona una actualización de cómo se puede usar esta información para mejorar los resultados sensoriales durante la FML y sugerencias para futuras prioridades de investigación en este campo.

Estrategias para llevar a cabo la fermentación maloláctica en vinos con pH elevado
Debido al cambio climático, el pH del vino ha aumentado gradualmente durante los últimos años y los vinos con niveles de pH superiores a 3,5–3,6 son cada vez más frecuentes. La fuerte disminución de la acidez total en los vinos tiene un gran impacto en la calidad del mismo, generando defectos en la calidad sensorial (por ejemplo, sabor menos ácido, cambios en el color, etc.) y favoreciendo el crecimiento de microorganismos no deseables (reduciendo la estabilidad del vino).6,12
Los valores superiores a pH 3,5 favorecen el crecimiento de especies como Lactobacillus y Pediococcus spp., mientras que O. oeni tiende a dominar a valores de pH más bajos.14 Esto ha impulsado que en los últimos años numerosos autores respalden el uso de cultivos iniciadores alternativos a O. oeni para el desarrollo de la FML.10,15,16 En la tabla 1 se muestra una descripción general de las estrategias y las especies microbianas utilizadas para desarrollar la FML en estas condiciones de pH. La especie Lactobacillus plantarum ha sido proclamada como una candidata adecuada para ser utilizada como cultivo iniciador para la FML ya que puede sobrevivir bajo condiciones de vinificación y posee muchas propiedades de interés tecnológico.17
Tabla 1. Estrategias para llevar a cabo la FML en vinos con pH elevado
Tabla_1

De hecho, durante el proceso de fermentación también puede llevar a cabo una serie de reacciones metabólicas secundarias de gran importancia para la formación de aromas en vinos,18,19 y exhibe un rango más amplio y mayor espectro de actividades enzimáticas que O. oeni.17,20 Cinquanta et al. estudiaron el efecto del pH en dos vinos italianos (falanghina y tintilia) inoculados con O. oeni, con L. plantarum o con una mezcla 50:50 de ambos.2 La duración de la FML estuvo influenciada por el pH y la cepa de BL utilizada. Ambas especies fueron capaces de completar la FML a pH 3,8, aunque no fueron capaces de completarla a pH 3,2. La cepa de L. plantarum mejoró las notas florales en los vinos blancos de falanghina y mostró un buen impacto organoléptico en los vinos tintos de tintilia, cuya intensidad sensorial se mejoró con una mezcla comercial (50:50) de O. oeni y L. plantarum.
Además se ha propuesto el uso de L. plantarum como método de acidificación biológica debido a su capacidad para producir altas concentraciones de ácido láctico.10,21 En esta línea, numerosas investigaciones van dirigidas a la selección y caracterización de cepas de L. plantarum para ser inoculadas en mosto.10,15,22 Una inoculación temprana en el proceso de vinificación es, además, aconsejable por la incapacidad de L. plantarum de crecer en presencia de más del 8% de etanol, de acuerdo con varios autores.15,23 Una de las ventajas de la coinoculación levaduras-bacterias en mosto es que no se sintetiza etanol en las primeras etapas de vinificación. Por lo tanto, se puede usar una BL más sensible, como L. plantarum, en lugar de O. oeni.20 Incluso a veces es posible programar la coinoculación de una mezcla de diferentes BL (L. plantarum y O. oeni) con levaduras para completar la FML de manera más rápida y segura.24 Otra ventaja de usar L. plantarum es que este organismo es homofermentativo para la glucosa,25 lo que evita el riesgo de aumentar la acidez volátil. La evidencia reciente sugiere el uso adicional de cepas seleccionadas de L. plantarum para la acidificación prealcohólica del mosto de uva.9,10,15,21,26-28 Lucio et al. realizaron una selección de cepas de Lactobacillus utilizando diversos criterios entre los que se priorizó la capacidad y eficiencia de crecimiento en mosto.10 Los resultados mostraron que cepas que crecían en mosto realizaron la FML, acidificaron el mosto, sintetizaron ácido láctico a partir de los azúcares y mostraron alta resistencia a la lisozima y al sulfuroso. Onetto et al. plantearon el uso de L. plantarum para reducir el pH a través de la acidificación del mosto previamente a la realización de la FA por parte de las levaduras.21 En su investigación, los azúcares disponibles fueron consumidos por las BL produciendo hasta 8,3 g/L de ácido láctico. El ácido láctico cambió el pH de 3,9 a 3,4 después de 14 días sin producirse concentraciones relevantes de ácido acético (0,34 g/L).
Una estrategia alternativa al uso de L. plantarum es la inoculación de levaduras no Saccharomyces, concretamente cepas de Schizosaccharomyces pombe para la disminución de la acidez mediante la fermentación maloalcohólica. La desacidificación biológica es posible gracias a la capacidad de esta levadura de consumir el ácido málico presente en el mosto o en el vino con la producción estequiométrica correspondiente de etanol y CO2.29,30 Para este objetivo, diferentes cepas de Schizosaccharomyces spp. han sido inmovilizadas en perlas de alginato,31 coinoculadas con S. cerevisiae o inoculadas secuencialmente.32,33 Sin embargo, hay que tener presente también que S. pombe se considera una levadura peligrosa debido a la producción de sabores desagradables asociados a su metabolismo. S. pombe se aísla comúnmente de vinos con deficiencias organolépticas y químicas y en los que se encuentran concentraciones importantes de ácido acético, acetaldehído, acetoína y acetato de etilo.33-35
Asimismo, es importante resaltar que en mostos de pH alto se observa un crecimiento muy rápido de microorganismos autóctonos, algunos de los cuales son considerados como microorganismos alterantes que pueden causar compuestos indeseables que afectan negativamente al vino, como por ejemplo la formación de fenoles volátiles o compuestos tóxicos para los humanos, como las aminas biógenas o micotoxinas.36 Para limitar el desarrollo de esta microbiota autóctona no deseada se recomienda la coinoculación de bacterias malolácticas seleccionadas (O. oeni/L. plantarum) junto con las levaduras responsables de la FA. Para llevar a cabo esta estrategia es necesario tener en cuenta la compatibilidad de las BL con las cepas seleccionadas de levadura,8,15,37,38 y se recomienda el empleo de cultivos iniciadores autóctonos por estar bien adaptados a las condiciones de un área vitivinícola específica.39 En cuanto a O. oeni, se ha visto que la coinoculación en mosto junto a cepas compatibles de S. cerevisiae evita el desarrollo de levaduras no deseadas como Brettanomyces bruxellensis. Berbegal et al. coinocularon diferentes cepas de S. cerevisiae, levaduras no Saccharomyces y O. oeni utilizando diferentes estrategias.40 Cuando se coinocularon S. cerevisiae O. oeni en mosto de la variedad nero di Troia contaminado con B. bruxellensis, los resultados mostraron una disminución en 4-etil guayacol y 4-etil fenol por debajo de su umbral de percepción sensorial tras 21 días del comienzo de la FA. Curiosamente, la población de B. bruxellensis también se redujo en presencia de O. oeni.40
Lucio et al. estudiaron las consecuencias de las interacciones de diferentes combinaciones entre dos cepas de L. plantarum y seis cepas comerciales de S. cerevisiae.8 Los resultados mostraron que fue posible controlar la acidez del vino coinoculando L. plantarum y S. cerevisiae. La FML se llevó a cabo con cualquier combinación BL/levadura, pero el grado de acidificación biológica dependió de la combinación de cepas utilizadas. Las investigaciones de Berbegal et al. mostraron que la coinoculación de S. cerevisiae y L. plantarum en mosto mejoraba la adaptación de las BL a las duras condiciones del vino.15 El procedimiento propuesto puede generalizarse como un método estándar para el diseño de cultivos iniciadores de MLF adaptados para mostos de pH alto.
Además del género LactobacillusPediococcus sp. es capaz de realizar la FML a pH elevados. Sin embargo, algunos pediococos sintetizan polisacáridos extracelulares, lo que puede conducir a la presencia de una viscosidad anormal en el vino. Una forma de solucionar este tipo de problemas es mediante ingeniería genética. Bauer et al. clonaron el gen maloláctico de Pediococcus damnosus NCFB1832 (mleD) en S. cerevisiae.41 La cepa genéticamente modificada de S. cerevisiae fue capaz de disminuir el nivel de ácido málico en mosto a menos de 0,3 g/L en 3 días.
Por otro lado, estudios recientes muestran que la supervivencia bacteriana está más relacionada con la evolución del pH durante la FML que con el pH inicial del mosto. Lerena et al. realizaron una evaluación de la capacidad de un nuevo cultivo iniciador de L. plantarum para completar la FML a escala de laboratorio y semiindustrial.42 En todos los casos, los mostos mostraron valores de pH iniciales superiores a 3,6, pero el pH mostró un comportamiento dinámico, cambiando a medida que avanzaba el FML. En fermentaciones en las que el pH aumentó con el tiempo, la cepa de L. plantarum metabolizó con éxito la mayoría del ácido málico que estaba presente originalmente en el mosto. Por el contrario, cuando el pH fue disminuyendo con el tiempo, los recuentos bacterianos se redujeron, al igual que la tasa de consumo de ácido málico.

Estrategias para llevar a cabo la fermentación maloláctica en vinos con pH bajo
El uso cada vez mayor de variedades de uva de bajo pH en la vinificación y el interés en la realización de la FML en vinos blancos y espumosos hacen necesario el estudio del comportamiento de las diferentes especies de BL durante la FML, la búsqueda de nuevas estrategias de inoculación y adaptación de los cultivos iniciadores a estas condiciones de bajo pH. La tabla 2 recoge una descripción general de las estrategias y las especies microbianas utilizadas para desarrollar la FML en estas condiciones de pH.
Tabla 2. Estrategias para llevar a cabo la FML en vinos con pH bajo
Tabla_2


Aunque recientemente las investigaciones buscan cultivos iniciadores alternativos a O. oeni, la mayoría de estudios hasta la fecha se han centrado en el estudio de esta especie por ser la más resistente a pH bajos. Una de las principales estrategias para llevar a cabo la FML en estas condiciones es caracterizar y seleccionar las cepas de O. oeni capaces de crecer y desarrollar la fermentación a pH bajos.43-46 Ruiz et al. realizaron un estudio comparativo utilizando una cepa autóctona (C22L9) y una cepa comercial de O. oeni en cuatro variedades de vino con niveles de pH bajo.43 Los resultados mostraron diferencias importantes tanto en la duración de FML entre vinos como entre cepas. La cepa autóctona presentó mejores propiedades sensoriales que la cepa comercial y por tanto podía usarse en vinos con diferentes características. Solieri et al. caracterizaron la diversidad genética y fenotípica de 135 BL aisladas de vinos italianos y realizaron una selección multifásica de nuevos cultivos iniciadores malolácticos de O. oeni.44 Los autores evaluaron las propiedades tecnológicas de diferentes genotipos de O. oeni en medio sintético con pH bajos (3,5, 3,2 y 3,0) y valores altos de etanol (10, 11 y 13% v/v), proporcionando una estrategia eficiente para seleccionar cepas de O. oeni con rendimientos de actividad maloláctica deseables y capaces de sobrevivir en condiciones que simulan condiciones de estrés en vino.
Estos estudios hacen patente la importancia del proceso de selección del cultivo iniciador para unas condiciones determinadas. Knoll et al. investigaron el impacto de diferentes estrategias de inoculación para llevar a cabo la FML con dos cepas diferentes de O. oeni en vinos de la variedad riesling con una alta acidez (pH 2,9-3,1).47 La estrategia de inoculación simultánea de levadura y bacteria mostró una reducción en el tiempo total de fermentación (FA y FML) en comparación con las inoculaciones secuenciales. En comparación con la inoculación secuencial, los vinos tendían a tener concentraciones más altas de ésteres etílicos y de acetato. Los resultados de este estudio ofrecen algunas alternativas para la realización segura de la FML en mostos blancos de clima frío y bajo pH y con alto contenido de alcohol.
Una segunda estrategia es proteger las células de las consecuencias del estrés causado por el pH bajo mediante la encapsulación o inmovilización de las BL. Genisheva et al. evaluaron la eficiencia de la inmovilización de células de O. oeni en diferentes soportes para la implementación de la FML en vino blanco,48 y Simó et al. valoraron la encapsulación de O. oeni en cápsulas de sílice-alginato.49,50 Estos estudios mostraron la protección de las células inmovilizadas contra los efectos inhibitorios del vino. Resultados positivos se han encontrado también al coinmovilizar S. cerevisiae y O. oeni en celulosa recubierta de almidón para llevar a cabo una FA y FML simultáneas51 o en perlas de alginato.52 La coinmovilización de S. cerevisiae y O. oeni permitió un proceso de fermentación eficiente, produciendo bajos niveles de acidez volátil y concentraciones de etanol y glicerol comparables a las obtenidas en una inoculación secuencial. La estrategia de coinmovilización generó en ambos casos una disminución significativa en el tiempo necesario para completar la FA y la FML. Otra forma de protección de las BL a las condiciones de estrés presentes en el vino es mediante el uso de glutatión para la recuperación del equilibrio rédox celular.53 A pesar de la incapacidad de O. oeni para sintetizar glutatión, esta bacteria puede asimilarlo del medio aumentando los ácidos grasos de ciclopropano en la membrana celular, tanto en la fase exponencial como en la estacionaria, lo que genera una mayor supervivencia de la bacteria en condiciones de estrés.
«Se podría usar la evolución dirigida como una herramienta para generar cultivos iniciadores de FML más eficientes, diseñados para vinos con múltiples factores de estrés como es el pH bajo.»
Con el fin de generar cepas de O. oeni capaces de llevar la FML en condiciones de estrés (alta concentración de etanol, bajo pH), Jiang et al. diseñaron una estrategia de evolución dirigida a partir de un cultivo continuo de esta bacteria.54 Se cultivaron diferentes cepas de O. oeni durante 350 generaciones en un ambiente similar al vino tinto en el que se iban aumentando los niveles de factores de estrés. Los resultados mostraron que tres cepas fueron capaces de finalizar la FML en 160 h, en condiciones de etanol de 15,1% (v/v), 26 mg/L de SO2 a pH 3,35, mientras que la cepa original no fermentó más de dos tercios del ácido L-málico presente en el medio. Estos hallazgos demuestran la posibilidad de usar la evolución dirigida como una herramienta para generar cultivos iniciadores de FML más eficientes, diseñados para vinos con múltiples factores de estrés como es el pH bajo.
Diversos autores proponen como alternativa a O. oeni el uso de cepas de L. plantarum y varios estudios han demostrado la capacidad de L. plantarum para crecer eficientemente a pH bajo.55-60 Por ejemplo, García-Alegría et al. describieron que varias cepas de L. plantarum aisladas de vinos tintos de la DO Rioja pudieron crecer con éxito en medio MLO a pH 3,2 y alcanzar concentraciones celulares similares a los de las cepas de O. oeni.60 Iorizzo et al. llevaron a cabo la caracterización tecnológica de 11 cepas de L. plantarum aisladas de vinos del sur de Italia.57 Estas cepas se caracterizaron según sus propiedades enológicas, su capacidad para producir aminas biógenas y bacteriocinas, su respuesta a la presencia de compuestos fenólicos, sus actividades enzimáticas, etc. Finalmente, se evaluó la actividad maloláctica en la variedad cabernet sauvignon, utilizando dos métodos de inoculación, demostrando que la cepa de L. plantarum seleccionada no producía aminas biógenas, mostraba una buena resistencia al pH bajo y etanol elevado, y tenía buenas actividades maloláctica y beta-glucosidásica. Succi et al. exponen además que la adaptación L. plantarum a condiciones de estrés subóptimas producen una mejora de la tolerancia al mismo estrés pero en condiciones más extremas.61 De hecho, algunas cepas mostraron una mejora en el µmáx cuando se expusieron a condiciones de estrés por ácido (pH 3,5) o etanol (8%) después de una adaptación a largo plazo a pH 5,0 o con 2% de etanol, respectivamente. Por otro lado, investigaciones recientes sugieren el uso de cepas de Pediococcus spp. en la vinificación. No obstante, también resaltan la falta de comprensión de los factores que influyen en el crecimiento y su potencial para causar alteraciones en el vino.16

Conclusiones
Gracias a las continuas investigaciones, actualmente poseemos una mejor comprensión de cómo la FML puede usarse para influir en el estilo del vino que se desea producir. La elección de la cepa de BL y el momento de la inoculación bacteriana son cruciales para poder realizar la FML y sobre todo en vinos con pH extremos. Además, un buen control de esta fermentación permite intervenir y modular las características sensoriales de los vinos.1 Las investigaciones futuras deben centrarse en aumentar el conocimiento de la diversidad microbiana, de las diferentes capacidades de resistencia a condiciones de estrés que tienen las diferentes cepas y las diferencias sensoriales que pueden aportar a través de la metabolómica62,63 y la genómica.64,65
Del mismo modo es interesante el estudio del origen geográfico de las cepas para la selección de cultivos iniciadores malolácticos resistentes a pH extremos.66,67 Además de poder seleccionar cepas adaptadas a las condiciones de un determinado estilo de vino, la inoculación de cepas autóctonas permite poner en valor el concepto de terroir.68 Sin embargo, el aislamiento de cepas potencialmente más adecuadas para el clima de una región en particular y las estrategias y condiciones de inoculación no se han estudiado en profundidad. Siguen haciendo falta nuevas investigaciones para encontrar cepas adecuadas para todas las condiciones y variedades de uva.1
En los últimos años se han buscado estrategias alternativas a la inoculación secuencial de O. oeni tras la FA para llevar a cabo la FML en vinos con condiciones difíciles. El uso de especies como L. plantarumP. damnosus o S. pombe es un área en creciente desarrollo y existen ya numerosos cultivos iniciadores comerciales.8,15,16,30
Por otro lado es necesario continuar las investigaciones sobre el efecto sinérgico de los diferentes factores de estrés que se encuentran en el vino y por qué algunas cepas se ven más afectadas que otras ante diferentes niveles de pH. Es imprescindible seguir evaluando fisiológica y metabólicamente los mecanismos de tolerancia a la toxicidad en las BL y los cambios de integridad de la membrana plasmática ante el estrés causado por pH bajos.
Por último, es necesario seguir aumentando el conocimiento a nivel genómico y transcriptómico de la especie O. oeni. Todavía no se han desarrollado sistemas de transformación ni es posible modificar la presencia y expresión génica en esta bacteria. La capacidad de ejecutarlo ayudará a delinear rápidamente las rutas metabólicas y sistemas de respuesta al estrés y se podrán desarrollar métodos para mejorar, por ejemplo, la expresión de los genes implicados en la FML ante determinadas condiciones de vinificación.

Bibliografía
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25/2/20

Contenido de cobre en suelos de viñedo ecológicos en denominaciones de origen catalanas


Lluís Giralt Vidal,Elisabet Perna Armengol,a Carme Masqué Tell,a Jordi Carbonell Galimany,a Josep Valiente Masdeu,a Ester Calaf Vidales,a Lorea Fernández de Larrinoa Arriola,b Lluís Serra Antolíc y Xoan Elorduy Vidalaa Institut Català de la Vinya i el Vi (Incavi).
b Universitat Rovira Virgili.
c Ingeniero técnico agrícola
.
Introducción
El control del mildiu de la vid (que llegó a Europa a finales del siglo XIX) se ha llevado a cabo con compuestos de cobre por su capacidad fungicida.
El cobre (Cu) es un elemento esencial para el desarrollo de las plantas que lo asimilan en pequeñas concentraciones, siendo catalogado como un microelemento en la fertilización. En la naturaleza, el Cu se presenta en forma de azufre, óxidos y carbonatos. Se encuentra principalmente en minerales como cuprita, malaquita, atzurita, calcopirita y bornita. La distribución entre los componentes del suelo puede verse considerablemente influenciada por la presencia de materia orgánica y los óxidos de Fe y Mn. En la mayoría de suelos minerales, el Cu suele estar combinado en forma de complejos arcilla-metal-orgánico, ya que en este tipo de suelo la materia orgánica está íntimamente ligada a las arcillas. Diferentes proyectos han estudiado los valores de los niveles de base y referencia de oligoelementos en los suelos, entre ellos el Cu. Concretamente, la Agencia de Residuos de Cataluña, en muestras realizadas en suelos naturales (suelos dedicados a prados, pastos y tierras forestales), ha hallado que la concentración media de Cu es de 22 mg/kg, con un mínimo de 1 mg/kg y un máximo de 330 mg/kg.1 En Francia, las medidas llevadas a cabo muestran una concentración media de 20 mg/kg de Cu, también con una fuerte variabilidad.2,3
Además del origen mineral del Cu, varias fuentes antropogénicas pueden aumentar la concentración en el suelo pudiendo causar situaciones de riesgo contaminante, estas fuentes son principalmente de fertilizantes agrícolas, fungicidas y bactericidas, los lodos procedentes de los residuos municipales y las emisiones industriales de la industria metalúrgica y de la combustión de carbón.1 Diferentes trabajos demuestran la importancia de este problema en el viñedo causado por la aplicación periódica de sales de Cu, encontrando mayores concentraciones de Cu en contraste con otros cultivos.4-6
Desde el inicio de la llegada del mildiu de la vid (Plasmopara viticola Berl. y Toni) a Europa a finales del siglo XIX, el control se ha llevado a cabo con compuestos de cobre debido a su capacidad fungicida. El uso de las sales de Cu comenzó con el caldo de bordelés (sulfato de cobre neutralizado con cal) y, con diferentes fórmulas, se han utilizado hasta hoy. Actualmente están autorizados en su aplicación contra el mildiu de la vid: hidróxido de Cu, oxicloruro de Cu, óxido cuproso y sulfato de cobre.7
«Las altas concentraciones de Cu sobre el terreno pueden causar problemas de fitotoxicidad o tener un impacto negativo en la sostenibilidad del sistema agrario.».
El cobre aplicado al viñedo termina principalmente en el suelo y, una vez allí, se puede acumular asociándose a diferentes componentes del suelo, transfiriendose a las aguas circundantes, transportándose asociado a sedimentos generados por fenómenos de erosión y/o afectando a los microorganismos del suelo.5 Las altas concentraciones de Cu sobre el terreno pueden causar problemas de fitotoxicidad o tener un impacto negativo en la sostenibilidad del sistema agrario por efectos en las comunidades microbianas y otros organismos como las lombrices de tierra. Estos efectos están condicionados por las características del suelo, especialmente por el pH y la textura del suelo y la concentración de carbono orgánico.5 Los valores de concentración de Cu en el suelo tinen un umbral de 100 mg/kg, y un valor por encima se considera necesario realizar una evaluación de la zona, y concentraciones superiores a 150 mg/kg indican un riesgo ecológico. Numerosos científicos indican concentraciones inferiores a 100 mg/kg como suelos no contaminados.4
La normativa europea de viticultura ecológica permite el uso de compuestos de Cu (Reglamento CE 967/2008),8 su origen mineral permite que se incluyan en los criterios de viticultura orgánica, sin embargo, las regulaciones genéricas para el uso de productos fitosanitarios incluyen restricciones en las dosis de Cu a aplicar, motivadas por los efectos contaminantes del Cu en el suelo y su poca solubilidad que lo convierten en un elemento muy móvil, así como los posibles efectos del Cu en la salud del aplicador.
La mayor restricción de la dosis anual de los tratamientos con Cu, en condiciones de fuerte presencia de mildiu, puede plantear un problema muy importante en su control, debido a la falta de alternativas efectivas en la agricultura ecológica. Ante esta situación, el Incavi, en colaboración con otras empresas del sector y otros centros de investigación, ha iniciado diferentes trabajos con el objetivo de estudiar los factores de la reducción de la dosis y/o el número de tratamientos de Cu en el viñedo, como el estudio de la permanencia del Cu en la vegetación después del tratamiento9 y el estudio de la eficacia de los productos de origen biológico en el control de mildiu.10
En consonancia con esta línea de trabajo se consideró muy oportuno conocer cuál es la situación real de concentración de Cu en los suelos vitivinícolas de Cataluña para poder evaluar su potencial contaminación tras un siglo de tratamientos y anticipar posibles efectos nocivos presentes y futuros.
La financiación de este proyecto ha sido a través de las subvenciones establecidas en el anuncio publicado por el Departamento de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación de la Generalitat de Catalunya: subvenciones para fomentar la investigación aplicada en materia de producción de agricultura ecológica.

Objetivos
Se ha trabajado sobre el objetivo general de obtener información real del nivel de concentración de Cu de los suelos de vid debido a los tratamientos de los compuestos de Cu en el control del mildiu de la vid. También se han recopilado datos sobre las condiciones agronómicas de las parcelas de muestra para poder analizar la importancia de los diferentes factores que pueden afectar a los niveles de Cu en el suelo. Para lograr este objetivo global, se especifican tres de ellos:
  • Cuantificar la concentración de Cu en el suelo de parcelas vitícolas en cultivo ecológico, en todas las denominaciones de origen vitivinícolas catalanas.
  • Relacionar las concentraciones de Cu en el suelo con la historia agronómica de cada parcela, especialmente con las aplicaciones de las sales de Cu.
  • Relacionar las concentraciones de Cu en el suelo con las características edafoclimáticas de las parcelas, especialmente con factores que pueden afectarla, como los niveles de materia orgánica del suelo, la textura, el pH o el régimen hídrico como factores de solubilidad, lixiviación y lavado.

Acciones realizadas / metodología
Elección de los puntos de muestreo
Las muestras se distribuyen en las diferentes denominaciones de origen vitivinícolas de Cataluña. Se ha trabajado en todas las DO vitivinícolas catalanas con el objetivo de poder dar un resultado representativo. El número de muestras por DO es mayor dependiendo de la superfície de viñedo y de las subzonas que incluyen (como es el caso de la DO Costers del Segre que tiene subzonas muy diferentes).
«Se priorizan las parcelas en cultivo ecológico, con el uso de las sales de Cu como elementos de protección prácticamente exclusivos contra el mildiu.»
A principios de febrero comienza el muestreo del suelo. La elección de parcelas y el contacto con los viticultores se lleva a cabo en colaboración con diferentes agentes del sector: técnicos de las denominaciones de origen vitivinícolas, agrupaciones de defensa vegetal o ADV, empresas vitivinícolas, etc.
Se priorizan las parcelas en cultivo ecológico, con el uso de las sales de Cu como elementos de protección prácticamente exclusivos contra el mildiu.
Muestreo
Las muestras se obtienen en las mismas condiciones en busca de las zonas de concentración potencialmente más altas:
  • Punto de recogida: en la hilera de las vides, entre cepa y cepa. Se considera que en esta área el suelo se laborea menos y/o a menos profundidad, por lo tanto el Cu que podría ser aportado en la superficie por los tratamientos se distribuirá menos en el suelo o estará menos incorporado en zonas más profundas.
  • Profundidad de la muestra entre 0 y 20 cm. Varias obras muestran que la presencia de Cu se reduce a medida que el suelo se profundiza, por lo tanto, la tierra superficial se recoge buscando el área donde puede ocurrir la mayor concentración.
  • Se recoge con una barrena manual y toma tierra de 10 a 20 cm, antes de recoger la muestra se retiran los restos de las plantas que pueda haber en superficie.
  • Para cada parcela elegida se hacen 8 agujeros (cuatro en dos filas), separados por unos 5 m.
  • De cada uno de los agujeros se toman alrededor de 100 gramos de tierra. Todas las tierras recogidas se colocan en una bolsa debidamente identificada para ser transportada en el laboratorio.
Se ha creado una ficha para recopilar información de las parcelas con los siguientes apartados:
  • Datos de la parcela (ubicación y datos agrícolas).
  • En caso de viñedo joven (cultivo anterior y años entre arranque y plantación).
  • Estrategia antimildiu aplicada.
  • Gestión del suelo (labrado, cubierta vegetal…).
  • Estado del suelo en la línea de las cepas en el momento del muestreo.
  • Erosión (pendiente, fenómenos de erosión).
  • Fertilización (química, orgánica o lodos de depuradora).
  • Agua (riego o fertiirrigación).
  • Especies vegetales presentes.   
El Incavi participa en el estudio para conocer la situación real de la concentración de Cu en suelos vitivinícolas de Cataluña, en la línea de fomentar la investigación aplicada en materia de producción de agricultura ecológica.
Puesta a punto de metodología y análisis de muestras
En el laboratorio de suelos de Incavi ubicado en la Estación Enológica de Reus se han puesto a punto las metodologías y la infraestructura necesaria para la realización de los análisis de la concentración de Cu:
  • Extracción de Cu biodisponible con EDTA. Es el Cu que se acompleja con la materia orgánica y la arcilla especialmente.
  • Extracción de Cu total con agua regia. Determina el conjunto de cobre bioasimilable, biodisponible, y el que se encuentra enlazado a estructuras cristalinas de óxidos, carbonatos, etc.
También se han analizado los parámetros fisicoquímicos del suelo que pueden tener incidencia en la concentración de Cu y su evolución:
  • Textura.
  • Materia orgánica.
  • pH.
  • Carbonatos totales.
  • Cal activa.
  • Capacidad de intercambio catiónico.

Resultados
Tabla 1: Muestras recogidas por denominación de origen
Tabla 1
Número de muestras
Durante la realización del proyecto (de febrero a octubre de 2019) se han recogido un total de 98 muestras distribuidas como recoge la tabla 1.
Parámetros edáficos generales
A fecha de hoy se han realizado los análisis de los parámetros que definen las principales características de los suelos vitícolas en un total de 95 muestras. Los resultados medios para DO exponen en la tabla 2.

Tabla 2: Resultados medios de los parámetros edáficos generales de las muestras por denominación de origen vitivinícola
Figura 2

Estas medias nos dan una idea global de las características de las muestras que se han recogido. La variabilidad de los suelos en Cataluña y en el propio territorio de las DO es muy grande.
Entre los factores que, a priori, tienen más incidencia en la concentración y la dinámica del Cu en el suelo destaca el pH. En este caso observamos como hay dos DO en que los valores se diferencian del resto por ser menos básicos: Empordà (pH medio 6,48) y Priorat (pH medio 7,23), tal como se puede ver en la figura 1.

Figura 1
Figura 1: Distribución del pH de las muestras recogidas por denominación de origen vitivinícola.
[Clique aquí para ver tablas y figuras en pdf]

A pesar de la diversidad de los suelos dentro de cada DO, estos datos permiten diferenciar estas dos como las zonas donde la situación puede ser más problemática, ya que en suelos ácidos es donde el Cu tiene mejores condiciones para ser bioasimilable por la planta, con riesgo de fitotoxicidad.
El otro parámetro Importante es la presencia de arcilla en la composiciones del suelo. En la figura 2 se puede ver que hay una gran variabilidad interna en las muestras recogidas en cada DO.

Figura 2
Figura 2: Distribución del porcentaje de arcilla de las muestras recogidas por denominación de origen vitivinícola.
[Clique aquí para ver tablas y figuras en pdf]

Sin haber ninguna significancia estadística, se puede destacar Priorat, Empordà y Tarragona por menor concentración y Terra Alta para estar la mayoría de sus muestras en la parte alta en concentración de arcilla.
La concentración de materia orgánica también tiene mucha importancia en la concentración y dinámica del Cu en el suelo. Globalmente se confirman los bajos porcentajes de materia orgánica en los viñedos de Cataluña. En la figura 3 se observan los niveles detectados.

Figura 3
Figura 3: Distribución del porcentaje de materia orgánica de las muestras recogidas por denominación de origen vitivinícola.
[Clique aquí para ver tablas y figuras en pdf]

Aunque se ven ciertas tendencias, se considera que los valores medios son similares.

Concentración de Cu
  •  Cu total
La tabla 3 muestra los resultados obtenidos en los análisis.

Tabla 3: Cobre total (mg/kg) de les muestras de las diferentes denominaciones de origen vitivinícolas de Cataluña
Figura 2

En la tabla 3 se exponen las medias de la concentración de Cu total del conjunto de muestras analizadas de cada DO. Se expone también la desviación estándar de cada media, que muestra una variabilidad de los resultados. Esta variabilidad es esperada, ya que la presencia de Cu en el suelo depende de numerosos factores y muy variables: la presencia natural de Cu según su composición mineral, la diferente aportación realizada por el viticultor, la presencia de materia orgánica, el nivel de erosión superficial, etc. Para subrayar esta variabilidad se indican los valores máximos y mínimos en cada DO. A partir de una concentración superior a 150 mg/kg se considera que pueden iniciarse alteraciones en el equilibrio natural del suelo. Por este motivo se expone el porcentaje de muestras que superan este valor en cada DO. Asimismo, para poder de valorar la situación de forma preventiva, se calcula el porcentaje de muestras que superan la concentración de 100 mg/kg de Cu.
Estos últimos datos permiten observar la incidencia de la problemática en el territorio estudiado. Por los resultados obtenidos podemos diferenciar tres grupos: en primer lugar el Penedès en que las muestras que superan los 100 mg/kg es del 54%, seguido de la DO Alella con un 50%, un tercer grupo las DO de Tarragona, Pla de Bages, Conca de Barberà, Empordà y Costers del Segre, donde el porcentaje de muestras superiores a 100 mg/kg de Cu están entre 15 y 20%, y finalmente les DO de Terra Alta, Montsant i Priorat en las que no se detecta ningún suelo con concentración superior a 100 mg/kg.
Para resumir la intensidad de la presencia de Cu en el suelo de viña, se observa la media de Cu total que en las muestras del Penedès, con un nivel medio de 99 mg/kg, está por debajo de las referencias. En el otro extremo las medias de Montsant (22,7 mg/kg) y Terra Alta (23,4 mg/kg), tienen niveles muy bajos. La figura 4 muestra la distribución de los resultados obtenidos en las diferentes DO.

Figura 4
Figura 4: Distribución del porcentaje de argila de las muestras recogidas por denominación de origen vitivinícola.
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Se puede observar la alta variabilidad entre los resultados y también como el conjunto de datos del Penedès se encuentra en su conjunto en un nivel más alto que el resto de denominaciones de origen.
Esta situación se puede explicar por la diferente aportación de Cu que, según la intensidad de las condiciones que favorecen el desarrollo del mildiu, son más o menos habituales e intensas.
  • Cu biodisponible
Recordemos que se define como el Cu que se acompleja con la materia orgánica y la arcilla especialmente, y por tanto, está con más disposición de pasar a ser asimilable por la planta.
Los resultados de los análisis se resumen en la tabla 4.

Tabla 4: Cobre biodisponible (mg/kg) de las muestras de las diferentes denominaciones de origen vitivinícolas
Figura 4

En este caso no se dispone de un nivel de referencia para valorar el riesgo de efectos negativos de los diferentes niveles de concentración. En todo caso los resultados muestran una relación positiva entre el nivel de Cu biodisponible y el Cu total.
En la figura 5 se hace una correlación entre las concentraciones de Cu total y de Cu biodisponible de las muestras analizadas.

Figura 5
Figura 5: Niveles medios de cobre total y cobre biodisponible de las muestras analizadas por denominación de origen vitivinícolas.
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El nivel de correlación es discreto, pero se observa una tendencia positiva de forma global de la relación entre las dos concentraciones.
Por lo tanto, los niveles de Cu biodisponible van relacionados con el nivel de Cu total, tal como se ve en la figura 6.

Figura 5
Figura 6: Niveles medios de cobre total y cobre biodisponible de las muestras analizadas por denominación de origen vitivinícolas.
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Los datos obtenidos en este trabajo muestran unas tendencias importantes, pero si se consideran de interés será necesario ampliar los trabajos a fin de darles significancia estadística.

Conclusiones
La concentración de Cu en los suelos de los viñedos estudiados está por debajo de los valores que se consideran de riesgo de contaminación. En la mayor parte de zonas, la concentración de Cu está muy por debajo de estos valores.
Se puede considerar que las zonas vitícolas catalanas que tienen menos presión de ataques de mildiu tienen unas concentraciones inferiores de Cu en el suelo, que aquellas en las que el control debe ser más intenso.
Gracias al proyecto que ha permitido la puesta a punto y la práctica de la metodología de trabajo, se dará continuidad a esta línea de investigación con el fin de ampliar y reforzar las conclusiones.

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10. Proyecto INTERREG POCTEFA, PALVIP 2018-2020. Disponible en https://palvip.univ-perp.fr/.

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