29/7/20

Brettanomyces: gestión enológica.

 

Víctor Puente1 y Vincent Renouf2
1 Director Técnico Laffort España
2 Director General Laboratoire SARCO ET EXCELL

La transformación del mosto de uva en vino resulta de la actividad secuencial de diversos microorganismos. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae, unas de las primeras en colonizar el mosto, degradan los azúcares de la uva y producen etanol y CO2 en un proceso denominado la fermentación alcohólica (FA). En este metabolismo carbonado central se injertan otros metabolismos secundarios que contribuyen a la formación de compuestos de interés organoléptico como los ésteres y alcoholes superiores que hacen del proceso fermentativo una etapa clave en la elaboración de los vinos de la calidad.1  Sobre vinos tintos y en algunos vinos blancos intervienen posteriormente las bacterias lácticas, principalmente la especie Oenococcus oeni, para degradar el ácido-L-málico en ácido-L-láctico con una liberación de CO2: se trata de la fermentación maloláctica (FML). Esta asegura una desacidificación biológica del vino y una evolución favorable de su perfil aromático.2

«Se usan calificativos tan dispares como 'medicinal', 'ahumado' o 'animal' para los olores conferidos por los compuestos causados por la levadura B. bruxellensis.» 
 

Pero no todas las intervenciones microbianas son favorables. De hecho, algunas pueden ser muy perjudiciales para la calidad del vino. Entre estas alteraciones microbianas, la producción de los fenoles volátiles (4-etilfenol y 4-etilguayacol) por la levadura Brettanomyces bruxellensis3 está considerada como una de las más problemáticas. Calificativos tan dispares como «medicinal», «ahumado» o «animal» se emplean para calificar los olores conferidos por estos compuestos,4 provocando una pérdida del carácter afrutado y perjudicando considerablemente la calidad y la tipicidad del vino.

Originaria de la uva,5 B. bruxellensis es una especie especialmente bien adaptada a las condiciones del vino. Su tolerancia, tanto a la presencia de oxígeno como a su ausencia, su crecimiento óptimo a los pH enológicos y sus reducidas exigencias nutricionales, le hacen un incómodo compañero de viaje en la elaboración de un vino, convirtiéndole en un importante competidor para el desarrollo de los procesos fermentativos. Esta acción competitiva es mayor cuando el grado probable es elevado, bien porque la presencia de Brettanomyces sobre este tipo de materia prima es inicialmente más elevada, bien porque Brettanomyces tolera mejor las cantidades elevadas de alcohol que S. cerevisae, tomando ventaja cuando la actividad de esta última declina.

En este artículo se proyectan acciones preventivas y correctivas dirigidas a un control de la población de B. bruxellensis durante el proceso de elaboración de un vino, desde la entrada de uva hasta los procesos de conservación previos al embotellado.

 

EN FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA: Colonización del nicho ecológico

Observemos el siguiente experimento. Se desarrolló una fermentación a escala de laboratorio exclusivamente con S. cerevisae (cepa 522 Davis, Laffort) y la misma, pero a través de una contaminación cruzada con distintas especias de levaduras no Saccharomyces, entre ellas Brettanomyces (tabla 1).

Tabla 1: Cepas usadas en las fermentaciones a escala de laboratorio

Tabla 1

 

 

Si atendemos al proceso fermentativo (fig. 1) desarrollado con tales inóculos, observamos que la velocidad de la fermentación del cultivo mixto y de S. cerevisiae puro prácticamente fueron similares hasta el día 7. A partir de ahí, la velocidad de consumo de los azúcares fue mayor para el cultivo mixto 1, indicando que las cepas no Sacharomyces intervinieron para finalizar la fermentación alcohólica. Además, a partir del día 4 de la fermentación alcohólica, la única cepa no Saccharomyces presente en el cultivo mixto fue B. bruxellensis.6 El resto de las especies no Saccharomyces apenas superó el 5% de la población total durante esos primeros 4 días de la fermentación alcohólica (datos no mostrados).

 

Figura 1

Figura 1: Consumo de glucosa y fructosa durante la elaboración a escala de laboratorio.

 

Si nos fijamos únicamente en la dinámica de poblaciones del cultivo mixto I (fig. 2) para S. cerevisae y B. bruxellensis, observamos que Brettanomyces comienza a crecer desde el día 1, y que alcanza al equilibrio en torno a los 12 días. Desde ahí hasta el día 25, prácticamente se desarrollan en paralelo, siendo desde esta fecha Brettanomyces la cepa predominante (fig. 2).

 

Figura 2

Figura 2: Evolución de poblaciones en cultivo mixto I: S. cerevisiae (en verde) es más rápida en comenzar con su actividad fermentativa, pero al final de la FA, B. bruxellensis (en rosa) le releva en esa función.

 

En este experimento se observa claramente que en una situación de contaminación cruzada, en situación de alta presión por parte de Brettanomyces en uva, son los vacíos ecológicos vinculados a una caída de actividad celular de S. cerevisae durante la fermentación alcohólica, cuando Brettanomyces, hongo oportunista, consigue imponer su metabolismo y crecer en ausencia de agentes que impidan su desarrollo. Técnicas enológicas destinadas a rellenar ese vacío microbiológico reducirán notablemente su crecimiento.

 

EN FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA: Evitar huecos ecológicos entre procesos

Al final de una FA, la población de S. cerevisiae –hasta ahora mayoritaria– disminuye y deja libre el nicho ecológico que ahora se disputarán B. bruxellensis y O. oeni. En esta rivalidad, la especie O. oeni lleva ventaja ya que dispone de un sustrato preferencial: el ácido-L-málico. Esto le permite multiplicarse y cuando su población alcanza 106 UFC/mL, se inicia la degradación del ácido-L-málico.

En el marco de una FML autóctona, el tiempo de latencia entre el final de la FA y el inicio de la FML depende principalmente de la población residual de O. oeni al final de la FA. Cuanto más baja es la población residual, mayor es el tiempo de crecimiento para alcanzar el umbral de 106 UFC/mL. En vinos con pH bajos y con elevada concentración de etanol, la población residual inicial tiende a ser muy baja (por debajo de 102 UFC/mL) y es durante este período de latencia entre las dos fermentaciones, cuando el ecosistema microbiológico del vino está vacante, convirtiéndose en una fase de inestabilidad microbiológica extremadamente favorable a la multiplicación de B. bruxellensis.

¿Qué tres situaciones nos podemos encontrar entre al inicio de una FML?  

  • Misma población: FML autóctonas «clásicas». Cuando tenemos poblaciones a niveles idénticos (103 UFC/mL), el paralelismo entre el crecimiento de O. oeni y el de B. bruxellensis es notable y sugiere interacciones entre las dos especies y ningún control competitivo sobre el nicho ecológico.
  • Población de O. oeni superior a 106 UFC/mL: situación tecnológica consistente en una siembra activa de inóculo de bacteria maloláctica seleccionada. Cuando se siembra una bacteria maloláctica, la población de O. oeni aumenta de manera importante y la cinética de FML es mucho más rápida, manteniéndose B. bruxellensis en niveles bajos de población. La población no aumenta hasta que termina la FML y la población de O. oeni decae.
  • Población de B. bruxellensis mayoritaria, superior a 106 UFC/mL: el crecimiento de B. bruxellensis predomina hasta que la población de O. oeni alcanza 106 UFC/mL, momento en que declina. Cuando finaliza la FML y la población de O. oeni inicia la fase de declive, B. bruxellensis se multiplica de nuevo.

 

Figura 3

Figura 3: Cultivos mixtos de B. bruxellensis (en rojo) y de O. oeni (en azul) inoculados a diferentes concentraciones en un vino de cabernet-sauvignon antes de la FML (pH = 3,6; TAV = 12% vol/vol, ácido-L-málico = 1,8 g/L).

 

Estos resultados confirman que el desarrollo de O. oeni autóctona durante la FML favorece el crecimiento de B. bruxellensis dado que, durante un período, ambas especies compiten por colonizar el nicho y aunque Oenococcus finaliza su función, Brettanomyces crece y se desarrolla durante el proceso maloláctico.7

Durante esta situación, la producción de fenoles volátiles, en los ensayos realizados, los porcentajes más bajos de estas moléculas indeseables se apreciaron en la partida donde la población de O. oeni era inicialmente la más elevada, lo que indica que la correcta gestión del nicho ecológico conlleva un mejor control de la población de Brettanomyces y una menor producción de fenoles volátiles indeseables.

¿Es importante una fermentación maloláctica rápida para la gestión de B. bruxellensis? Obviamente, sí. Se ha observado una relación directa entre el número de días necesario para el desarrollo de una fermentación maloláctica y la población total de Brettanomyces observadas en el mismo (fig. 4).

Figura 4

Figura 4: Relación entre la población de B. bruxellensis presente en los vinos y el número de días necesarios para alcanzar el final de FML.

Ello nos lleva a concluir que cualquier proceso que limite o reduzca el tiempo de finalización de la fermentación malolácticalimitará la presencia de Bretanomyces y, por tanto, la formación de los tan temidos etilfenol (EF) y etilguayacol (EG).

Un proceso que conlleva a reducir los tiempos y por tanto a la gestión de Brettanomyces es la coinoculación Saccharomyces-Oenococcus. Los beneficios de esta técnica como complemento tecnológico dirigidos a cerrar espacios a la entrada de oportunistas microbiológicos es el objetivo de esta operación implantada en bodega ya desde hace varios años. Su base tecnológica consiste en colonizar desde un primer momento el nicho ecológico, rellenando el hueco microbiológico con las dos especies fermentativas más importantes del proceso enológico, S. cerevisae y O. oeni.

Cuando la densidad del mosto ha caído unos 10 puntos y S. cerevisae se encuentra ya consumiendo azúcares, es cuando tecnológicamente se puede realizar la siembra con O. oeni. Este proceso, denominado coinoculacion temprana, es interesante en vinos con pH ligeramente superior a pH 3,3. En condiciones de pH inferiores, la cantidad inicial de SO2 molecular con efecto inhibidor sobre los microorganismos (bastante superior sobre las bacterias) es más importante.

Durante el curso de la fermentación alcohólica, sobre todo en su fase inicial, la actividad fermentativa de las levaduras provoca un ligero descenso del pH,8 dejando en situación aún más restrictiva la viabilidad de O. oeni. Para estos vinos, puede ser mucho más interesante una coinoculacion tardía, en la que la siembra de la bacteria O. oeni se realiza sobre en densidad 1010 y el pH del medio fermentativo ya ha aumentado. En ambos casos provocamos que la FA y FML se vinculen en el tiempo cerrando el espacio para el desarrollo de microorganismo indeseables, entre ellos Brettanomyces, y acortando con ello el proceso maloláctico (tabla 2).

 

Tabla 2: Efecto de la coinoculación levadura-bacteria sobre la población de Brettanomyces
en contraposición a una FML espontánea

Tabla 2

 

 

EN CONSERVACIÓN: Empleo de agentes que favorezcan la limpidez

Cualquier proceso que reduzca la presencia de lías o su compactación tras los procesos fermentativos y aumente los fenómenos naturales de clarificación fomentará la caída de las células de Brettanomyces en suspensión. La disminución de la viscosidad del vino y la eliminación del soporte físico que la turbidez pueda ejercer sobre esta población incrementarán la velocidad de sedimentación, sobre todo si se emplean enzimas beta-glucanásicas que corten los sustratos coloidales y favorezcan su precipitación (tabla 3).

 

Tabla 3: Efecto del trasiego temprano y el empleo de beta-glucanasas en la conservación de los vinos

Tabla 3

 

 

Este proceso de precipitación espontánea podría adelantarse y/o incrementarse si forzamos el efecto de clarificación con el uso de agentes clarificantes que aglomeren las células de B. bruxellensis. Ensayos realizados sobre vinos franceses mostraron la eficacia de la acción del empleo de agentes clarificantes proteicos sobre esta microbiología indeseable (fig. 5).

 

Figura 5

Figura 5: Efecto del empleo de una gelatina animal sobre la presencia de Brettanomyces bruxellensis sobre vino terminado (Vino 1 = Medoc, Vino 2 = Côtes de Castillon, Vino 3 = Bordeaux).

 

EN CONSERVACIÓN: Anhídrido sulfuroso

El anhídrido sulfuroso es el principal mecanismo de defensa contra la proliferación de Brettanomyces y del resto de la microbiología no amiga, ejerciendo no solo una acción microbiológica, sino también antioxidante como captador de oxígeno importante para la conservación del vino. El contenido de dióxido de azufre molecular activo es el único que tiene propiedades antisépticas y depende principalmente del contenido de dióxido de azufre libre y del pH. Una concentración de dióxido de azufre activo molecular de 0,4-0,5 mg/L tiende a ser suficiente para inhibir la proliferación, aunque no para impedirla completamente. ¿Por qué?

Porque el sulfuroso no siempre es suficiente. Dependiendo de la población, la temperatura o el grado alcohólico pueden ser necesarias cantidades mayores. Además, investigaciones actuales han puesto de manifiesto la resistencia hacia el sulfuroso de determinadas especies del género Brettanomyces.9 Durante estos estudios se caracterizaron varios cientos de estas cepas por análisis genético de microsatélites (zonas repetidas del genoma) y como resultado se obtuvo que un 40% de las cepas analizadas eran resistentes a los sulfitos en la habitual concentración de 0,4 mg/L de SO2 molecular. Todas las cepas que son resistentes a los sulfitos tienen la particularidad de tener un patrón genético de tipo triploide para algunas secciones de su secuencia genética.

En vinos con alta carga de B. bruxellensis (fig. 6) ya se observó que correcciones de sulfuroso elevadas (30 o 60 mg/L) para un pH bajo disminuían la carga microbiológica de Brettanomyces rápidamente. Tras 2 meses de conservación, la población derivaba hacia una mayor resistencia al sulfuroso mostrando un crecimiento paulatino de la población en el tiempo.10

 

Figura 6

Figura 6: Efecto del empleo de SO2 sobre una población activa de B. bruxellensis (grado alcohólico = 12,8, pH = 3,4, G+F = 2,1 g/L). Barras color azul población analizada y sulfuroso añadido en el momento de embotellado.

 

Una primera vía de acción novedosa es poder trabajar sobre ese sulfuroso libre, es decir, ayudar con procesos que deriven en un aumento de ese sulfuroso libre para una misma concentración de sulfuroso total. El acetaldehído es una de las moléculas que más fácilmente se combina con el sulfuroso de un vino y por tanto la que más podría alterar ese sulfuroso libre. Las especies más productoras de acetaldehído son Pichia y Hansenioaspora, aunque S. cerivisae también lo produce, por lo que su control durante la FA es fundamental.

Este acetaldehído siempre se encuentra en niveles cercanos a 50 mg/L en los vinos y su fluctuación dependerá tanto de su producción por parte de las levaduras, oxidaciones parciales por parte de etanol en contacto con el oxígeno, como por su consumo tanto por las reacciones de polimerización en tintos como por las bacterias lácticas. Esta última es otra de las vías para conseguir niveles bajos de combinación de sulfuroso y por tanto un aumento de su concentración molecular para un mismo pH.11

Las bacterias lácticas consumen este acetaldehído, y en situaciones de coinoculación (anteriormente citadas), además de evitar los vacíos ecológicos, reducen la acumulación de parte del acetaldehído debido a un equilibrio entre lo que produce Saccharomyces y lo que consume Oenococcus, limitando su combinación, manteniendo un SO2 libre –y, por tanto, SO2 molecular– superior durante un mayor período (tabla 4).

 

Tabla 4: Concentración de anhídrido sulfuroso libre para una misma dosificación de anhídrido sulfuroso total

Tabla 4

 

 

 

EN CONSERVACIÓN: Empleo de quitosano fúngico

Fue ante la falta de soluciones plenamente satisfactorias cuando la Organización Mundial de la Viña y el Vino (OIV) aprobó el empleo de quitosano de origen exclusivamente fúngico como una nueva herramienta enológica para el control de Brettanomyces. El quitosano, sin propiedades alergénicas conocidas y con una estructura química y molecular similar a la quitina, puede insertarse en la pared celular del hongo y alterar su estructura. Este «engaño» en la reconstrucción de la estructura de la membrana de Brettanomyces genera una perturbación de la permeabilidad de su membrana, que afecta a su viabilidad celular, y por tanto provocando su muerte.

Su tratamiento sobre vinos de quitosano fúngico puro se ha mostrado eficaz al disminuir la población de Brettanomyces, aunque dependiendo de su población y resistencia no siempre ejerce una acción total sobre el vino.10 Este hecho podría estar vinculado a que Brettanomyces necesita activamente cierta actividad metabólica en el consumo del quitosano y ante su ausencia (células en estado vegetativo o ausentes de metabolismo) tan solo una acción iniciadora pude provocar su activación. En experimentos conjuntos con enzimas beta-glucanásicas que actúen sobre la membrana de Brettanomyces se pudo eliminar totalmente su presencia y mantener su ausencia en el tiempo, probablemente vinculado a la mejora coloidal y por tanto a una mejor acción clarificante (fig. 7).

 

Figura 7

Figura 7: Efecto del empleo de SO2, quitosano y beta-glucanasasobre una población activa de B.bruxellensis (grado alcohólico = 12,8, pH = 3,4, G+F = 2,1 g/L). Barras color azul población analizada. En las barras, sulfuroso añadido en el momento de embotellado.

 

EN CONSERVACIÓN: Madera

Curiosamente a lo que se tiene pensado, si la contaminación proviene originalmente del vino que se va a conservar sobre madera es mucho más factible observar un crecimiento indeseado de Brettanomyces sobre barrica nueva que sobre barrica vieja. Este hecho se justifica por el hecho de que sobre barrica nueva la transferencia de oxígeno es mucho mayor que sobre madera vieja, creciendo a un ritmo mucho más alto que en una barrica vieja (fig. 8). Por ello, la necesidad de verificar la ausencia de contaminación inicial sobre el vino a conservar en barrica es fundamental.

 

Figura 8

Figura 8: Efecto de la conservación de un mismo vino y en mismas condiciones de un vino sobre barrica nueva y barrica vieja.

 

EN CONSERVACIÓN: Filtración

Los procesos de filtración sobre placas, tierras o tangencial son una de las últimas vías para el control de la población ya no solo de Brettanomyces sino de la población contaminante presente y aunque cualquier proceso de filtración disminuye la población de Brettanomyces presente, tan solo a través de filtraciones inferiores a 1 µm es posible una eliminación total de la población de Brettanomyces, mientras que por filtraciones con micrajes superiores tan solo conllevan una reducción temporal de la contaminación12,13 (fig. 9).

 

Figura 9

Figura 9: Efecto de una filtración sobre placas de celulosa sobre una población activa de B. bruxellensis.

 

 

Conclusiones

B. bruxellensis naturalmente perteneciente al amplio elenco de microorganismos enológicos está particularmente adaptada a situaciones vínicas de alta concentración de alcohol, situaciones de anaerobiosis o aerobiosis y bajas concentraciones de nitrógeno. Estos hechos provocan que su ausencia total durante el proceso de elaboración de un vino sea sumamente irreal.

Mecanismos de control como la ocupación de los vacíos ecológicos por S. cerevisae o O. oeni se vuelven primordiales para evitar que esta especie oportunista colonice el nicho.

Agentes que provoquen su eliminación, bien por efectos de clarificación, inhibición o filtración, proporcionan las herramientas necesarias para su control y gestión durante todo el proceso de elaboración de un vino.

 

Bibliografía

1. Darriet P, Barbe C, Lavigne-Cruège V, Pineau B, Pons A, Sarrazin E, et al. Caractérisation et développement de la typicité aromatique des vins de Bordeaux. 8e Journée Technique du CIVB, 2007, p. 29-37.

2. De Revel G, Martin N, Pripis-Nicolau L, Lonvaud-Funel A, Bertrand A. Contribution to the knowledge of malolactic fermentation influence in wine aroma. Journal of Agriculture and Food Chemistry 1999; 47: 4003-8.

3. Suárez R, Suárez-Lepe JA, Morata A, Calderón F. The production of ethylphenols in wine by yeast of the genera Brettanomyces and Dekkera: a review. Food Chemistry 2007; 102: 10-21.

4. Chatonnet P, Dubourdieu D, Boidron JN. Le caractère phénolé des vins rouges: caractérisation, origine et moyens de lutte. Revue Française d’Œnolologie 1992; 138: 21-4.

5. Renouf V, Lonvaud-Funel A. Development of an enrichment medium to detect Dekkera/ Brettanomyces bruxellensis, spoilage wine yeast, on the surface of grape berries. Microbiological Research 2007; 161: 154-67.

6. Renouf V, Falcou M, Miot-Sertier C, Perello MC, De Revel G, Lonvaud-Funel A. Interactions between Brettanomyces bruxellensis and other yeasts species during the initial stages of winemaking. J Appl Microbiol 2006; 100: 1208-19.

7. Renouf V, Puente V, Murat ML. Biorregulación de Brettanomyces bruxellensis en vinos: gestión del nicho ecológico por especies vínicas. Enoviticultura 2010; 7: 10-5.

8. Akin H. Evolution du pH pendant la fermentation alcoolique de moûts de raisins: modélisation et interprétation métabolique. Tesis doctoral. Institut National Polytechnique de Toulouse, 2008.

9. Renouf V, Etourneau L, Nicolato T, Zaldívar E, Palacios A. Detección y cuantificación de cepas Brettanomyces bruxellensis resistentes al sulfuroso. La Semana Vitivinícola 2019; 3557: 2107-9.

10. Puente V, Soto F, Palacios A. Brettanomyces y SO2. ¿Suficiente para controlar su crecimiento? La Semana Vitivinícola 2015; 3452: 1382-5.

11. Puente V, Hernando J, Martos A, Nieto J, Tobes A, Renouf V. Coinoculación de Saccharomyces cerevisiae-Oenococcus oeni. La semana Vitivinícola 2013; 3408: 1542-5.

12. Renouf V, Perello MC, De Revel G, Lonvaud-Funel A. Microbiology of bottled wines: impacts of the filtration. Am J Enol Vitic 2007; 58: 379-80.

13. Renouf V. Description et caractérisation de la diversité microbienne durant l’élaboration du vin: interactions et équilibres. Relation avec la qualité du vin. Institut National Polytechnique de Toulouse, 2006.

16/7/20

Brett: origen y factores enológicos del carácter fenolado en el vino.

 

Antonio Palacios
Laboratorios Excell Ibérica
Logroño, La Rioja

www.labexcell.com

Introducción

Brettanomyces es una levadura conocida hace ya tiempo, pero no muy a fondo. La problemática que genera es algo que no puede dejar de estar sometido a las modas, polémicas, mitos, contradicciones y correcciones milagrosas que surgen como legiones salvadoras y que contribuyen a complicar enormemente un problema grave, pero tan complejo, que algunos prefieren creer que no existe. La abundancia de información sobre el tema de diversa índole y calidad afecta a su gestión y a la solución del problema Brettanomyces, centrado principalmente en los vinos tintos, aunque algunos blancos, especialmente elaborados en contacto de las pieles, y algunos espumosos, no están siempre a salvo. Este artículo tiene por objetivo poner el punto sobre los elementos claves que pueden influir significativamente en el desarrollo de este microorganismo para dar paso a modo introductorio a las herramientas prácticas y eficaces en el control de su desarrollo y en su efecto sensorial negativo.

 

Ecología y origen de Brettanomyces en el vino
               
Este problema fundamental ha sido, desgraciadamente, tratado de forma polémica en los últimos años, lo que ha provocado muchos malentendidos y confusiones entre los profesionales. En primer lugar, el microorganismo ha sido descrito como una infección por levaduras, un término que sugiere que su presencia se produce solo en vinos anormales o excepcionales, lo que no es del todo razonable ni cierto. De hecho, esta levadura está presente en todos los ambientes fermentativos o casi, vino incluido. Entonces, varios estudios se han esforzado en demostrar que las uvas vienen ya repletas de Brettanomyces, para sugerir que es la viña el origen principal de la fuente de contaminación.

Obviamente, Brettanomyces no ha llegado de Marte en una nave espacial ni en un meteorito. Sin embargo, todos los estudios ecológicos dejan claro que la frecuencia de detección de esta levadura en la uva es baja o muy baja (0-3% de las levaduras presentes en uva) en la gran mayoría de los casos. Así, solo se detecta en configuraciones específicas, es decir:

  • uva más o menos alterada con pérdida de la integridad de su película, o
  • en el caso de parcelas posicionadas a favor del viento de las fuentes de contaminación masivas (vertidos de bodegas elaboradoras o envasadoras) que pueden llegar a tener poblaciones y consiguientemente existe la posibilidad de presentarse como un problema.

Estas situaciones poco comunes deben ser identificadas de forma temprana para programar un sulfitado de la cosecha a un nivel mayor de lo normal (7-8 g/hL) y luego realizar una inoculación con un cultivo iniciador seleccionado que sea masivo y conocido para poder controlar la vinificación industrial y evitar las contaminaciones durante los procesos fermentativos.

Pero en otras situaciones, ¿cuál es la fuente de contaminación de Brettanomyces? Como ocurre con todos los microorganismos responsables de la transformación de la uva en vino, ¡pueden ser los equipos de bodega! Sin embargo, Brettanomyces está muy poco presente o ausente, debido a que la microbiota del proceso fermentativo, levaduras y bacterias lácticas, normalmente se multiplican más rápidamente que ella. Sin embargo, las características de su metabolismo y la capacidad de adaptación a las condiciones difíciles, como es el caso de las paradas o los accidentes de ralentización de la cinética fermentativa, hacen que rápidamente puedan colonizar el medio y luego producir diferentes alteraciones.

 

Figura 1

Figura 1: Fotografías al microscopio de diferentes morfologías de Brettanomyces bruxeliensis.

 

Comenzamos explicando el mayor desarrollo observado en ocasiones en barricas de roble nuevas, en sospecha por algunos enólogos como una fuente de contaminación potencial de los vinos al fomentar el crecimiento de Brettanomyces desde un punto de vista técnico. ¡De hecho, no es así! La explicación es muy diferente. En primer lugar, Brettanomyces no es parte de la microbiota normal de la madera. Además, las barricas se calientan en su fabricación entre 150 y 230 °C, lo que conlleva su esterilización si es que estuviesen contaminadas.

La cantidad de azúcares asimilables liberados por la madera de barricas nuevas para Brettanomyces es pequeña comparada con la que existe ya de forma natural en los vinos. Las barricas viejas siguen siendo una fuente mucho más importante de contaminación que las nuevas, ya que contienen potencialmente el inóculo y, además, pueden contener ya etilfenoles en su masa porosa. No obstante, con la presencia potencial en el vino inicialmente contaminado (es decir, en casi todos los casos), y destacando que la cinética de desaparición de dióxido de azufre libre durante la crianza como único antiséptico activo es más rápida en barricas nuevas que en las usadas (potencial oxidativo más elevado, mayor evaporación y transpiración), resulta entonces poco activo y de forma limitada contra Brettanomyces. Así, paradójicamente, se deduce que Brettanomyces en algunos casos puede crecer más rápido en las barricas nuevas que en las viejas, incluso a pesar de presentar un inóculo inicial nulo o mucho más bajo. Entonces, el nivel de dióxido de azufre siempre se debe revisar con más frecuencia en las barricas nuevas, en especial de forma temprana durante la crianza, para evitar sorpresas desagradables durante la crianza.

Otra fuente de competitividad que hace a la levaduramás potente todavía es su capacidad de esporulación. Brettanomyces es en realidad el anamorfo del género Dekkera, correspondiendo esta última a la forma esporulada, por lo que se puede concluir que ambos nombres en realidad corresponden al mismo género de levaduras. En cualquier caso, parece demostrado que Brettanomyces es asexual, no produce esporas y es sensible al anhídrido sulfuroso, mientras que Dekkera es la forma sexual, produce esporas y es bastante más resistente al sulfuroso.

 

¿Cuáles son los factores y prácticas enológicas que influyen en el desarrollo de Brettanomyces en bodega?

La maceración prefermentativa (MPF) es una práctica que se puede utilizar para la vinificación de vinos tintos con el objetivo de promover la extracción de color y taninos. Esta práctica se considera en algunas ocasiones un riesgo, pero esta afirmación no es exacta si la técnica se realiza correctamente. En primer lugar, como se mencionó anteriormente, Brettanomyces no forma parte o muy poco de la microbiota natural de la uva y menos aún si el sulfitado se ha realizado de modo óptimo y como requiere esta práctica (> 5 g/hL). Entonces, a no ser que el mosto esté infectado de forma precoz y grave (en uvas alteradas o contaminadas por la bodega), la población de Brettanomyces no es detectable o se encuentra en minoría (de 5 a 10% de la microbiota formada por levaduras) a los 5 días de maceración, que ya es mucho tiempo o al menos excesivo. ¡Pero si Brett se encuentra ahí, entonces perdurará!

La realización de maceración en frío inicial impone utilizar uva sana suficientemente sulfitada y enfriada a una temperatura adecuada (< 10 °C). En estas condiciones no hay riesgo de contaminación. Además, es aconsejable no manipular la uva por bombeo (para evitar la contaminación a través del material de bodega) y no pasar de 5 días como tiempo máximo razonable, para así evitar cualquier riesgo de contaminación inesperada.

Cualquier accidente encontrado en el flujo de trabajo del proceso de la fermentación representa una oportunidad para el desarrollo de Brettanomyces, pues se trata del microorganismo contaminante oportunista por excelencia. Los casos de contaminación después de una fermentación no son infrecuentes, pero es especialmente importante en el caso de retrasos en el sulfitado después o antes de la fermentación maloláctica, y si esta presenta una cinética languideciente, el riesgo es más alto. En estos casos, una inoculación temprana de bacterias lácticas es más que recomendable, aunque la eficacia de esta técnica se ve a veces comprometida por las dificultades del medio frente a la óptima implantación de las bacterias seleccionadas inoculadas para combatir el problema.

Los factores ambientales influyen en el metabolismo y en el crecimiento de Brettanomyces/Dekkera sp. En cuanto a la composición del vino, el contenido de etanol afecta negativamente a la capacidad de Brettanomyces para crecer, pero no se debe soñar, ya que vinos de hasta 15,5% v/v de etanol pueden ser alterados por cepas adaptadas a este tipo de entorno.

Un aumento del pH facilita enormemente la multiplicación de Brettanomyces. El pH de los vinos blancos y rosados, naturalmente más ácidos (pH < 3,5) normalmente los protege de cualquier desarrollo significativo de Brettanomyces/Dekkera. Por debajo de 15 °C, el crecimiento se desacelera bruscamente. El aumento de la temperatura favorece la multiplicación hasta 32 °C, lo que explica que la frecuencia de contaminación sea más baja en invierno y aumente bruscamente en primavera y en verano.

En consecuencia, se tiende a pensar que la disminución de la temperatura de las bodegas de crianza muy por debajo de 15 °C reducirá el riesgo de desarrollo de Brettanomyces. Sin embargo, debe recordarse que la combinación etanol/dióxido de azufre molecular en su correcto valor es lo más eficaz en la limitación de las poblaciones, al incrementar significativamente la duración de su fase de latencia. Sin embargo, el contenido de dióxido de azufre molecular depende, para un pH dado, de la cantidad de SO2 libre y de la temperatura. Por lo tanto, en gran medida, reducir la temperatura de la bodega alcanza un límite en su eficacia muy rápidamente. Además, la reducción de la temperatura puede tener otra desventaja (en el caso de acondicionamiento con aire seco artificial, la evaporación de vino y la oxidación es mayor, la proporción madera/vino es más importante y la velocidad de evolución del vino además cambia). Por lo tanto, en la práctica, una temperatura comprendida entre 15 y 17 °C es la ideal. Más allá de 20 °C, el riesgo de contaminación aumenta exponencialmente y la vigilancia debe aplicarse en consecuencia al riesgo asumido.

Como se puede verificar en la figura 2, las poblaciones de Brettanomyces en forma de células viables no son constantes a lo largo del año, sino que siguen ciclos de crecimiento y muerte, como si la lavadura entendiese de ciclos biodinámicos. Es en primavera y otoño cuando se presentan los mayores crecimientos poblacionales. Por el contrario, el aumento de los metabolitos propios de las levaduras contaminantes, los etilfenoles, no aumentan en estos períodos del año, sino que lo hacen cuando más mortalidad celular acontece, haciendo pensar que los enzimas vinil-reductasas se expresan de forma más intensa en esta situación de estrés o bien porque sea una actividad extracelular liberada con la muerte y la propia autólisis celular.

 

Figura 2

Figura 2: Evolución durante 2 años de Brettanomyces y etilfenoles.
(Cortesía de Bruce Zoecklein, Enology - Grape Chemistry Group, Virginia Tech, Estados Unidos.)

 

El contenido del vino en azúcares residuales es otro factor de sensibilidad positiva. ¡El riesgo de contaminación aumenta exponencialmente con el contenido de azúcar residual! Brettanomyces es una levadura capaz de utilizar muchos azúcares diferentes, entre ellos algunos diholósidos como la trealosa, que puede liberarse al final de la fermentación alcohólica a partir de Saccharomyces (sobre todo si la levadura está bajo condiciones de estrés) y durante la crianza sobre lías. Una cantidad residual de azúcares (glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, sacarosa, trealosa) inferior a 0,35 g/L puede ser suficiente para permitir el desarrollo de una población (1.000 células/mL) capaz de sintetizar un contenido de etilfenoles igual o mayor a su umbral de percepción (450 μg/L). Sin embargo, esta cantidad de azúcar está disponible en una gran mayoría de vinos tintos después de la fermentación alcohólica y maloláctica. Desde 1 g/L, el riesgo de contaminación aumenta peligrosamente.

La calidad y la velocidad de la finalización de los procesos de fermentación y la limitación de los recursos energéticos disponibles son los principales factores de control del riesgo de Bettanomyces. Entonces, debido a la mayor disponibilidad de determinados sustratos procedentes de las lías y su efecto protector frente al dióxido de azufre, la crianza sobre lías en vinos tintos sigue siendo una práctica que indirectamente puede promover el desarrollo de Brettanomyces, por lo que debe reservarse para situaciones saludables y siempre limitadas en el tiempo. Se recomienda entonces una retirada de las lías antes del verano. Además, el seguimiento debe ser lo más riguroso posible, sobre todo si el vino tiene factores de composición favorables (pH > 3,7 en particular).

El roble no es la causa más frecuente de la aparición del carácter Brett en vinos envejecidos en barricas. Sin embargo, es evidente que la estructura microporosa de la madera es un refugio ideal para los microorganismos en general. Las barricas usadas entonces son una fuente obvia de contaminación; Brettanomyces no solo crece muy bien, como ya hemos citado en las barricas nuevas, sino también en los depósitos de material inerte. Por supuesto, es mucho más fácil limpiar y desinfectar los tanques de acero inoxidable con una superficie lisa que las barricas o las cubas de madera. Así que la investigación en las técnicas de control de higiene de los recipientes de madera que sean capaces de reducir el riesgo de desarrollo de este microorganismo durante el envejecimiento de los vinos, es completamente necesaria llevarla a cabo.

 

Figura 3

Figura 3: Reservorio natural de la porosidad de la madera de barricas donde anida Brettanomyces.
(Cortesía del Dr. J.A. Scott, School of Chemical Engineering, University of Bath, Bath, Reino Unido.)

 

Brettanomyces también puede desarrollarse durante el envejecimiento en botella más o menos al azar (o puede verse afectadas la totalidad de las unidades de un mismo lote si la microfiltración antes del embotellado no es la adecuada). Este microorganismo también ha sido detectado tardíamente a partir de vinos viejos embotellados, por lo que refleja una notable capacidad para sobrevivir en el tiempo. En la mayoría de los casos, las poblaciones son extremadamente bajas antes del embotellado. Debido a su resistencia al dióxido de azufre, las concentraciones usadas en el embotellado no permiten destruir totalmente las levaduras residuales. Una vez que el contenido de anhídrido sulfuroso libre ha disminuido lo suficiente (por la oxidación natural), Brettanomyces puede volver a crecer y producir los suficientes fenoles volátiles como para causar un daño organoléptico a pesar de partir de una población muy baja. Las condiciones de control y la eliminación de las poblaciones de Brettanomyces de forma preventiva, especialmente en estado quiescente (difícil de detectar) representan un reto importante para garantizar el desarrollo sano de los vinos embotellados.

 

 

Consecuencias sensoriales del carácter fenolado

El carácter fenolado o carácter Brett es relativamente común en los vinos tintos y afecta gravemente a las variedades aromáticas más típicas. Es aquí donde principalmente, por no escribir únicamente, Brettanomyces es un problema grave en enología. En efecto, si dejamos a Brettanomyces que evolucione de forma natural en los vinos, ya sean de Burdeos, California, Sudáfrica, con la variedad merlot, syrah o tempranillo… ¡al final todos tendrían el mismo aroma! Adiós a la tipología varietal y a la identidad geográfica del terruño. Dicho esto, en cuestión de vinos, lo más importante se centra en el estilo y el gusto diferenciado que podemos encontrar en el mercado. Algunos elaboradores y aficionados aprecian o buscan este tipo de sabor, no importa, ya se invocó hace tiempo a la tipicidad del famoso terroir o a la impronta de la variedad de uva para explicar el olor de cuero y de sudor de caballo que exhalan estos vinos: pero esto es el pasado y se trata solo del pestilente olor de Brettanomyces.

No existen estadísticas fiables sobre la frecuencia de carácter Brett en los vinos. Sin embargo, solo los tintos, veremos por qué más adelante, se ven afectados mayoritariamente por este problema. Un análisis realizado hace algún tiempo, ahora significativo, en un gran número de botellas repartidas por todo el mercado a escala internacional ha mostrado que aproximadamente un tercio estaban afectadas por un defecto potencialmente detectable en la degustación (con una concentración de etilfenol por encima del umbral de percepción, que es más de 600 μg/L y para la mezcla de 4-etilfenol/4-etilguaiacol de unos 460 μg/L en una proporción de 8:1, ratio observado con mayor frecuencia en comparación con otros). Parece que la proporción de ambos fenoles es ahora importante y que algunas regiones están más afectadas que otras (fig. 4). Por lo tanto, parece necesario revisar los mitos y realidades en torno a este sujeto para aportar soluciones prácticas a aquellos que deseen verdaderamente dominar la contaminación en bodega.

 

Figura 4

Figura 4: Mapa mundial vitivinícola de la presencia de Brettanomyces.

 

Maratón de cata IWC
 
El concurso International Wine Challenge (IWC), con más de 9.000 vinos presentados, es uno de los mayores concursos de vinos del mundo. También es uno de los pocos en su estilo con importantes recursos dedicados al análisis de los defectos encontrados por los jueces durante el desarrollo de la cata de los vinos presentados. El maratón de dos semanas de cata presenta una valiosa oportunidad para almacenar datos de los defectos detectados en vinos de calidad, los cuales, después de cuidadosos análisis, pueden ser de gran utilidad para el mercado. Esta información es esencial para los enólogos que buscan aumentar su reputación (y con ello las ventas) en mercados extranjeros, ya que la identificación de los problemas hace posible su solución, o lo que es aún mejor, poder evitarlos, algo muy significativo para el desarrollo colectivo de la industria enológica en un mercado global (fig. 5).

 

Figura 5

Figura 5: Porcentajes medios de defectos organolépticos encontrados en el IWC.

 

El defecto que nos merece la pena ahora tener en cuenta, en relación con la levadura contaminante Brettanomyces, es el que aparece cuando se producen los fenoles volátiles generando aromas animales y gustos sucios y terrosos en el vino. Un significativo número de vinos tintos mostraron niveles supuestamente por encima del umbral de esos fenoles volátiles, el 10,6 % de los vinos considerados como defectuosos fueron rechazados por este problema. Sin embargo, con un mercado de vinos de alta gama que se dirige hacia la moda de la mínima intervención y filtración antes del embotellado, es posible que muchos de esos vinos considerados como defectuosos tuvieran células activas de Brettanomyces o bacterias lácticas residuales en la botella, lo que indica que la situación a futuro de los mismos con toda seguridad es la de empeorar. Los enólogos entonces deberían usar técnicas enológicas apropiadas para dirigir los procesos fermentativos y asegurar que el vino sea microbiológicamente estable antes y después del embotellado. El vino debería nacer microbiológicamente hablando y madurar con la paciencia de la cinética química, y no al revés.

 

El caso de La Rioja

Cambiando a la parcela económica del problema y analizar cómo influye sobre la misma el carácter Brett, podemos poner el ejemplo de lo que ha ocurrido en una importante denominación de origen española donde la crianza en barrica forma parte de su marchamo de mayor valor e imagen. En los últimos años el sector vitivinícola de La Rioja ha experimentado una importante expansión, y se ha convertido en una fuente de riqueza económica esencial para la región. El precio medio estimado del vino para cada una de las categorías es de: 2,63 €/L para el vino genérico; 3,77 €/L para el tipo crianza; 5,58 €/L para el reserva y 9,38 €/L el gran reserva. En cuanto a las ventas de rioja por categorías, el vino tinto con crianza en barrica es la categoría más vendida. Le sigue en volumen de ventas la categoría con contraetiqueta genérica. En conjunto, la participación de los vinos tintos criados en barrica supera el 65% de las ventas totales (en la actualidad, unos 160 millones de litros ubicados en 1.285.000 barricas). Las categorías de reserva y gran reserva han contribuido a que La Rioja se haya convertido en una de las regiones vinícolas más prestigiosas del mundo.

Como ejemplo práctico y real, en la figura 6 se representan 13 vinos crianza de la DOCa de la variedad tempranillo que fueron catados a ciegas por cuatro expertos de carácter internacional mediante evaluación hedónica. Se representan sus puntuaciones frente a las unidades olfativas según la concentración de etilfenoles en relación con su umbral de percepción. Como se puede observar, parece que para obtener una alta valoración cualitativa del vino es necesario mantener una concentración baja de etilfenoles, sin embargo, su ausencia o baja concentración, no garantiza el éxito. Por esta última razón el coeficiente de correlación de la recta no es muy elevado (R2 = 0,5085), pero manifiestan la tendencia.

 

Figura 6

Figura 6: Puntuación en cata hedónica frente a unidades olfativas de etilfenoles de vinos tempranillo 2008 con crianza en barrica.

 

Sirvan todos estos datos económicos para comprender la importancia que tiene en La Rioja mantener una calidad de vinos con crianza en barrica adecuada. Entonces, si la distinción a escala internacional del rioja es el vino criado en roble, lo que requiere una elevada inversión (el parque de barricas riojano se estima en 400.000.000 €), el problema archiconocido del carácter fenolado por contaminación de Brettanomyces se puede considerar como un factor de alto riesgo, sobre todo en un escenario de mercados internacionales.

Entre las conclusiones que podemos sacar de la figura 6, es muy significativo que para el volumen de vino que representan estas 13 muestras de crianza, marcas muy conocidas y de gran volumen, las bajas concentraciones de etilfenoles sean tan menguadas. Ello indica que efectivamente existe una revolución silenciosa que ha hecho disminuir drásticamente la incidencia del problema en los vinos criados en barricas de roble. Esta revolución silenciosa se basa en la aplicación de técnicas vitícolas y enológicas adaptadas para evitar la contaminación del vino y/o la aplicación de técnicas curativas sobre el vino contaminado. Aunque esto no sea visible en el entorno sectorial, es una evidencia loable desde el punto de vista tecnológico.

Sin pretender relacionar directamente el problema de Brettanomyces con la competitividad de una bodega, mostramos a continuación un ejemplo muy práctico de cómo efectivamente puede existir una relación entre vinos afectados y precios más bajos. En la misma figura 6 se muestran los vinos etiquetados con sus precios de venta al público (PVP). Como se puede observar, los precios más altos aparecen en la parte derecha (vinos con menor concentración en etilfenoles) y los precios más bajos en la izquierda (vinos con mayor concentración). De esta observación se desprende que, a medida que los vinos tienen mayor preferencia y menor concentración en etilfenoles, el precio de venta al público se incrementa. De los precios más bajos encontrados (4,78 €) a los más altos (8,25 €) existe una horquilla muy significativa de casi 3,5 €/botella, lo que no es nada desdeñable en un mercado tan disciplinado como el de rioja.

 

Figura 7

Figura 7: Relación entre la puntuación en cata hedónica y el precio de venta al público (PVP) de vinos tempranillo crianza.

 

Siguiendo en esta línea, se realizó un estudio de correlación entre los precios de venta al público, las puntuaciones en cata hedónica y la concentración en etilfenoles, para verificar si existe alguna relación entre estas variables. Como se puede ver en la figura 7, también existe una correlación, esta vez positiva y con un coeficiente R2 más elevado que en el caso anterior (0,641) entre el PVP y la puntuación en cata. De nuevo, y sin querer ser categóricos, podemos decir que la composición del vino que condiciona sus características organolépticas, como son los etilfenoles, puede influir en el posicionamiento del producto en el mercado y, por lo tanto, en su precio y evolución a lo largo de la historia de la marca.

 

Los estudios del AWRI

En un estudio del Australian Wine Research Institute (AWRI), donde se utilizó un panel de 30 catadores profesionales para determinar los umbrales sensoriales de detección de los compuestos causantes del defecto Brett en tres vinos diferentes de la variedad cabernet sauvignon (uno tipo multirregional blend relativamente neutro, otro de un estilo verde inmaduro y el último con larga crianza en roble), se pudo verificar como los umbrales de aroma para el 4-etilfenol (fig. 8) fueron inferiores a los indicados anteriormente en la bibliografía (605 μg/L, Chatonnet et al. 1992). Además, para todos los compuestos implicados en el carácter Brett, el estilo del vino tuvo un marcado efecto en los umbrales; así, el vino criado en barrica presentaba los umbrales más elevados.

El estudio también muestra cómo el 4-etilguayacol tiene un umbral relativamente elevado, por encima de la concentración notificada en prensa científica hasta la fecha, lo que indica que no puede ser un contribuyente importante del defecto Brett. Esta investigación confirma entonces que el estilo del vino en cuestión tiene un efecto transcendental para la percepción del vino por parte del consumidor y para sus preferencias.

 

Figura 8

Figura 8: Umbrales sensoriales de etilfenoles en tres estilos de vino diferentes: neutro, inmaduro y crianza en barrica.
(Cortesía de Belinda Bramley et al., AWRI 2007).

 

Este mismo centro de investigación australiano, con otro panel sensorial compuesto por 112 consumidores, calificó mediante cata hedónica con escalas de 9 puntos (no le gusta extremadamente hasta le gusta extremadamente) y cata descriptiva con escalas de intensidad de atributos de aroma y gusto de 11 muestras de vino por triplicado. El experimento contaba con tres muestras a diferente nivel del defecto Brett por tipología (neutro, vegetal y con madera): el mismo vino base neutro utilizado en las pruebas anteriores, ese vino con isobutilometoxipirazina y otra vez el mismo vino con volátiles añadidos de roble (whiskylactonas, vainillina, guayacol y 4-metilguayacol). El nivel del carácter Brett se definió con la adición de 4-etilfenol y 4-etilguayacol en una proporción de 9:1 para los niveles bajos (600 g/L de 4-etilfenol + 67 g/L de 4-etilguayacol) y para los niveles altos (1.200 g/L de 4-etilfenol + 133 g/L de 4-etilguayacol), estimando al vino base neutro como el testigo exento del problema.

El vino base neutro fue descrito por los consumidores como el vino con más aromas afrutados de bayas negras en el análisis descriptivo, sin embargo, la muestra neutra con adición de elevadas cantidades de etilfenoles (alto carácter Brett), fue calificada como la más intensa en aromas de cuadra, tirita, medicina, cuero, especias picantes y gusto metálico. La presencia de compuestos inmaduros del tipo pirazinas o de aromas de roble, reducen la intensidad de percepción de los atributos relacionados con el carácter Brett, como se puede observar en a figura 9 (superior).

A partir de los datos hedónicos de consumidores (fig. 9, inferior), se ve que el vino mejor valorado es el de base neutra, mientras que el mismo vino con alto carácter Brett es el que menos gusta. Por otra parte, a los consumidores les gustó menos el vino con roble que el vino base neutro, pero puntuando igual el vino con roble con altos niveles Brett que al vino base neutro limpio, lo que indica que la supresión mutua del efecto del roble y el carácter Brett da como resultado un vino más agradable que cualquiera de sus componentes por separado.

 

Figura 9sup
Figura 9inf

Figura 9: Puntuaciones medias en aroma medicinal/cuero de tres estilos de vino diferentes: neutro, inmaduro, crianza en barrica con tres concentraciones de etilfenoles (gráfico superior) y cata hedónica (gráfico inferior).
(Cortesía de Belinda Bramley et al., AWRI 2007.)

 

Consideraciones generales del problema Brettanomyces en bodega
y acciones enológicas

Prácticas enológicas

Los factores y prácticas enológicas que más influyen en el desarrollo de Brettanomyces en el vino son los siguientes:

  • La maceración prefermentativa (MPF), que es una práctica que se utiliza en tintos con el objetivo de promover la extracción de color y taninos. Esta práctica se considera en algunas ocasiones un riesgo, pero esta afirmación no es exacta si la técnica se realiza correctamente.
  • Los casos de contaminación después de lafermentación alcohólica no son infrecuentes, pero es especialmente importante en el caso de retrasos en el sulfitado después o antes de la fermentación maloláctica. En estos casos, una inoculación temprana de bacterias lácticas es más que recomendable.
  • Ciertos factores ambientales influyen en el metabolismo y crecimiento de Brettanomyces/Dekkera sp. En cuanto a la composición del vino, el contenido de etanol afecta negativamente. Un aumento del pH facilita enormemente la multiplicación de Brettanomyces. Con respecto a la temperatura, por debajo de 15 °C el crecimiento se desacelera bruscamente.
  • El contenido del vino en azúcar residual es otro factor de sensibilidad positiva. El riesgo de contaminación aumenta exponencialmente con su presencia. Brettanomyces es capaz de utilizar una amalgama completa de azúcares: glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, sacarosa y trehalosa.
  • La calidad y velocidad de la finalización de la fermentación alcohólica son factores muy importantes en el control del riesgo, simplemente por razones de ocupación de un nicho ecológico con posibilidades.
  • La generalización de la crianza sobre lías constituye un itinerario enológico que, como recurso para aumentar la estructura en boca de los vinos, funciona muy bien, pero al aportar nutrientes y crear un ambiente reductor, puede favorecer el desarrollo de la levadura contaminante al mismo tiempo.
  • El roble no es la causa más frecuente de la aparición del carácter Brett en vinos envejecidos en barricas. Sin embargo, es evidente que la estructura microporosa de la madera es un refugio ideal para los microorganismos en general. Además, aporta azúcares como la celobiosa, que aumentan el riesgo. Por esta misma razón, incrementar el uso de derivados de madera también es una acción a tener en cuenta.
  • La microoxigenación, como práctica enológica para eliminar aromas vegetales y reducidos, además de estabilizar el color, puede influir en el desarrollo del contaminante, sobre todo si se hace antes de la fermentación maloláctica. Se trata de una levadura capaz de desarrollarse en anaerobiosis estricta, pero la presencia de oxígeno favorece su desarrollo y estimula la síntesis de acidez volátil.
  • La nueva tendencia hacia la reducción de dosis, e incluso la eliminación, del anhídrido sulfuroso es uno de los factores que más ha contribuido a la extensión del problema, junto con la moda de renunciar a cualquier intervención enológica, como la clarificación, estabilización y por supuesto la filtración, haciendo posible la presencia del microorganismo en diferentes etapas de la elaboración.
  • Brettanomyces también puede desarrollarse durante el envejecimiento en botella. Una vez que el contenido de anhídrido sulfuroso libre ha disminuido lo bastante, Brettanomyces puede crecer y producir los suficientes fenoles volátiles como para causar un daño organoléptico a pesar de partir de una población muy baja.

 

Herramientas

Se presentan a continuación de forma muy resumida las acciones y herramientas disponibles que se pueden utilizar en bodega en torno al problema de Brettanomyces.

Aplicaciones preventivas

  • Técnicas vitícolas en prácticas agronómicas: una de las fuentes del contaminante se encuentra en las uvas, y su composición determina su capacidad de desarrollo posteriormente en el vino. Vigilar y valorar su estado sanitario es vital para crear rutas enológicas acordes a su estado.  
  • Sulfitado: aunque Brettanomyes/Dekkera es relativamente resistente, un nivel de dióxido de azufre molecular de 0,5 mg/L suele ser suficiente para inhibir la proliferación sin impedirla completamente; de 0,7 a 0,8 mg/L el contenido debería ser letal.
  • Mechado de barricas: la acción del dióxido de azufre gaseoso es particularmente interesante para la desinfección de la superficie porosa y de los primeros milímetros de las duelas de las barricas. Hoy en día han aparecido técnicas complementarias en el proceso de lavado y desinfección de barricas muy interesantes, como vapor, ozono, ultrasonidos, microondas y H2O-.
  • Higiene y desinfección de los equipos de bodega: procesos totalmente cruciales, en los que de nuevo las nuevas tecnologías antes mencionadas también aportan mucho valor y ayuda.
  • Coinoculación levaduras/bacterias lácticas:para la realización de la fermentación maloláctica, impidiendo el desarrollo de Brettanomyces principalmente en su fase de latencia.
  • Control biológico: como sistema de intervención enológica muy manejable hoy en día y que permite ser incluso muy respetuoso con la imagen natural del producto.

 

Figura 10Figura 10Figura 10 Figura 10

Figura 10: Tecnologías anti-Brettanomyces. [De arriba hacia abajo] Altas presiones hidrostáticas, pasteurización flash, radiación ultravioleta y quitosano.

Aplicaciones curativas (fig. 10)

  • Tratamientos físico-térmicos: la pasteurización flash o relámpago –también conocida por las siglas HTST (acrónimo del inglés high temperature/short time)– es una técnica eficaz para la destrucción de todo tipo de microorganismos en el vino.
  • Tratamientos físico-separativos: la filtración en el caso de Brettanomyces, especialmente al final de la crianza del vino cuando las células son pequeñas, requiere membranas con un poro menor de 1 µm (idealmente, 0,65 µm). La centrifugación puede disminuir su presencia, pero no eliminarla del todo.
  • Otros tratamientos físicos: se han propuesto y ensayado tratamientos como la esterilización mediante radiaciones ultravioleta (UV), altas presiones (>200 MPa) y pulsos eléctricos (PEF >15 kV/cm).
  • Quitosano de origen fúngico: que destruye las células de Brettanomyces impidiendo la formación de etilfenoles.
  • Dimetildicarbonato (DMDC): aunque su uso está limitado al momento del embotellado, tiene bastante poder resolutivo.

 

Tratamientos correctivos para eliminación de etilfenoles

  • Clarificación del vino: con productos adsorbentes del tipo PVPP y carbón activo desodorante.
  • Levaduras inactivas específicas (LIE o SIY): que consiguen eliminar proporciones importantes de fenoles volátiles gracias a su efecto esponja.
  • Nanofiltración y retención en columna de carbón activo: con la eliminación selectiva en el permeato que contiene el 35-40% de los etilfenoles totales del vino.
  • Polímeros impresos moleculares (MIP): han revelado buena capacidad de extracción y limpieza de matrices complejas, tales como etilfenoles en el vino. Los MIP son polímeros sintéticos con sitios de reconocimiento capaces de unirse específicamente a una molécula objetivo.

 

Sistema de diagnóstico de Dekkera/Brettanomyces

Es evidente que existe la necesidad imperiosa de realizar un seguimiento del problema en bodega de una forma exhaustiva, para así poder diagnosticar la situación microbiológica del vino y su afectación sensorial. Para ello existen las siguientes metodologías analíticas (fig. 11):

Figura 11Figura 11Figura 11 Figura 11

Figura 11: [De arriba hacia abajo] Técnicas analíticas de tipo microscopía, medios de cultivo, cromatografía y citometría de flujo.

  • Observación microscópica: evocada como técnica válida para «identificar» la presencia de Brettanomyces, pero teniendo en cuenta ciertas precauciones, ya que es irreal distinguir de forma precisa exclusivamente por morfología celular, pero si sirve como señal de alarma en un barrido amplio de muestras.
  • Medios de cultivo específicos: en este caso, como en todos en modo Brett, es importante la recogida de muestras previo homogeneizado del vino, ya que no es un germen móvil y, por lo tanto, tiende a depositarse en el fondo del recipiente (una buena opción en la toma de muestras de barricas es hacerlo directamente del fondo de la misma). Hay que tener en cuenta que los medios no son totalmente específicos para Brettanomyces/Dekkera, pudiendo dar falsos positivos y que el recuento de células viables requiere un período de cultivo de unos 12 días. Además, la enumeración no tiene en cuenta gérmenes viables no cultivables (VNC), que se corresponden con células que están en un estado de estrés fisiológico, siendo incapaces de multiplicarse en un corto plazo de tiempo, aunque en realidad sí pueden hacerlo posteriormente. Sin embargo, Lucile Pic y Jacques Mathieu del ICV francés, aconsejan el uso de medios de cultivo en la evaluación del riesgo de carácter fenolado a corto plazo y el PCR junto a la citometría de flujo a medio o largo, ya que las formas viables no cultivable (VNC) cuando el sulfuroso activo baja con el tiempo, pueden convertirse en viables cultivables (VC), en cuyo estado fisiológico son capaces de producir de nuevo elevadas concentraciones de etilfenoles.
  • Diagnóstico cualitativo Sniff Brett®: que consiste en un medio de cultivo líquido que desprende el aroma de los etilfenoles después de varios días de incubación. La intensidad relativa de riesgo es inversamente proporcional al tiempo de aparición del olor, siendo un método semicuantitativo, ya que la virulencia metabólica depende a nivel de cepa y hay una amplia biodiversidad dentro de la especie.
  • Cromatografía de gases y espectrofotometría de masas (GCSM): para el seguimiento periódico de los etilfenoles en el vino; se trata de una técnica muy fiable y rápida, lo que permite reaccionar proactivamente en bodega (trasiegos, sulfitado, filtrado, etc.).
  • Técnicas de biología molecular: como PCR a tiempo real (PCRrt), que permite medir con precisión y sensibilidad (10 células/mL) el número de células presentes. En la práctica, esta tecnología tiende a sobreestimar ligeramente la población activa real, ya que hay un tiempo entre la muerte y la desaparición total del DNA amplificable por la polimerasa. Con la PCRrt, por lo tanto, se miden las células totales, siendo particularmente útil durante la preparación de los vinos a embotellar, para evaluar la estabilidad microbiológica del vino y especificar el medio filtrante óptimo a utilizar antes del embotellado.
  • Citometría de flujo: técnica diseñada para el recuento de células independientemente de su tamaño y estructura mediante el empleo de anticuerpos específicos acoplados a fluorocromos. Técnica atractiva por su sencillez y velocidad de ejecución, aunque tiene una baja sensibilidad de detección (> 200 células/mL).

 

Conclusión

El problema Brettanomyces/Dekkera es cada vez más importante en todo el mundo y los elementos básicos que influyen en su desarrollo en los vinos son conocidos desde hace algún tiempo. Sin embargo, tal vez debido a un debate innecesario en los últimos tiempos, la proporción de vinos tintos alterados con un carácter Brett se pronuncia claramente en crecimiento.

«La gestión de Brettanomyces necesita respuestas y métodos de prevención y curación sistemáticos no necesariamente complejos.».
 

La gestión de Brettanomyces necesita respuestas y métodos de prevención y curación sistemáticos no necesariamente complejos. No hay duda, y ciertamente no es necesario tratar de prohibir totalmente en las bodegas a Brettanomyces como microbiota natural, pero sí parece conveniente aprender a manejarla en un nivel seguro en la elaboración de vino de principio a fin. Para ello, se deben seguir ciertos principios y reglas de sentido común que ahora están documentadas científicamente; así, hay que empezar en la viña, que a menudo es subestimada, mal entendida o, peor aún, ignorada, y, a continuación, llevar a cabo fermentaciones de buena calidad en bodega.

Son muchas las herramientas que se ofrecen a los productores y bodegueros para seguir, analizar y diagnosticar la presencia de Brettanomyces en las diferentes etapas de su desarrollo, por ello es esencial hacer una buena selección de todas ellas. Una excelente profilaxis en la supervisión general y elegir lo que se precise en cada paso son la clave para utilizar métodos más adecuados en el control completo de un microorganismo tan brillante como oportunista y que parece adecuarse perfectamente a las condiciones del vino. El mínimo error o relajación promueve que Brettanomyces/Dekkera siempre esté ahí para llenar un vacío que la naturaleza aborrece.

Sin ser muy categóricos, podemos decir que existe una relación, no matemática, pero si casuística, de puntuaciones altas en cata y mejores precios de venta asociados a contenidos bajos de etilfenoles. O dicho de otro modo: los vinos con menos problemas de Brettanomyces permiten una venta más rentable para la bodega elaboradora y seguramente un mayor disfrute en su consumo; sí podemos afirmar que, al menos, así queda demostrado por jueces expertos y consumidores encuestados.

De los resultados que se muestran en este artículo, se deduce que el problema de Brettanomyces está en una situación de claro descenso en algunas importantes regiones vitivinícolas, en especial en las que el porcentaje de vinos madurados en barrica es importante respecto del total. Estos datos demuestran claramente que se están aplicando técnicas enológicas bien adaptadas al problema con el objetivo de minimizar el «drama» lo máximo posible,algo muy admirable desde el punto de vista profesional del sector enológico y reflejo evidente de lo que se puede llamar «revolución silenciosa».

 

Bibliografía general

Barbin P. Contrôle et éléments de maîtrise de la contamination par la levure Brettanomyces au cours du processus de vinification en rouge. Tesis, Institut National Polytechnique de Toulouse, 2006. Disponible en: https://oatao.univ-toulouse.fr/7560/1/barbin.pdf.
Bramley B, Curtin C, Cowey G, Holdstock M, Coulter A, Kennedy E, et al. Wine style alters the sensory impact of “Brett” flavour compounds in red wines. 13th Australian Wine Industry Technical Conference (AWITC), Adelaida, 2007.
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10/7/20

Empleo de ácido fumárico y quitosano para inhibir la fermentación maloláctica.

 

Antonio Morata, M.ª Antonia Bañuelos, Iris Loira, Andrea Villegas, Carmen González
y José Antonio Suárez Lepe
enotecUPM. Universidad Politécnica de Madrid.

Introducción

La fermentación maloláctica (FML) se desarrolla inoculada o no de forma habitual en vinos tintos; sin embargo, es más infrecuente en vinos blancos y rosados. Aunque en ocasiones sucede, incluso de forma indeseada, restando acidez y por tanto frescor a los vinos. En la actualidad, y quizás debido a consecuencias del cambio climático como la elevación del pH en los vinos, aumenta la frecuencia de estas FML indeseadas. Se pueden desarrollar distintas estrategias para evitar la FML no deseada.1 Entre ellas su control mediante aditivos bactericidas o bacteriostáticos, o el uso de técnicas físicas no térmicas (tabla 1).

En este trabajo se van a evaluar las ventajas del empleo de dos aditivos altamente efectivos en la inhibición de la FML: el quitosano y el ácido fumárico. Del primero está permitido su uso en vinos como clarificante,2 aunque como efecto colateral tiene una alta capacidad para bloquear el desarrollo de la FML.3 El segundo aceptado como acidificante y saborizante en el Codex alimentarius FAO-WHO en alimentos,4 y su capacidad inhibitoria sobre la FML en vinos se conoce desde los años setenta del siglo pasado.5

 

Tabla 1: Técnicas para impedir la fermentación maloláctica en vinos

Tabla 1

HHP: altas presiones hidrostáticas; PEF: campos eléctricos pulsados; UHPH: ultrahomogeneización a alta presión.
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El quitosano es un polisacárido (β-1, 4-D-glucosamina parcialmente desacetilada) con densidad de carga positiva e insoluble (fig. 1). Se produce por desacetilación de la quitina que se puede obtener del exoesqueleto de crustáceos o de origen fúngico.7

 

Figura 1

Figura 1: Estructura del quitosano, acetilado y desacetilado.
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Varias empresas producen quitosano de origen fúngico para ser utilizado como clarificante y antimicrobiano y es de uso ecológico.22 El quitosano es insoluble, se mezcla con agua o una fracción de vino, se homogeneiza con el total y luego se retira una vez realizada la clarificación coloidal; se recomiendan periodos de contacto de unos 10 días.22 En este proceso se retiran microorganismos entre los que pueden estar bacterias lácticas, acéticas y levaduras alterantes como Brettanomyces.

El ácido fumárico (ácido trans-butenodioico; CAS# 110-17-8; PM 116,07 g/mol) es un sólido blanco poco soluble en agua y fácilmente analizable por LC-DAD por su alta respuesta en el UV debido al doble enlace. Dosis de hasta 600 mg/L de ácido fumárico no se detectan sensorialmente en pruebas triangulares.13 En ensayos de preferencia se observa en los vinos tratados con ácido fumárico una mayor acidez, un ligero efecto en el cuerpo, y en tintos un color más intenso por la modificación del pH.13

El efecto de quitosano y ácido fumárico es complementario, ya que el ácido fumárico aporta persistencia y protección postratamiento en botella, mientras que el del quitosano termina una vez se retira el clarificante.

 

Metodología

Para los ensayos de inhibición se ha usado la cepa Uvaferm Alpha® (Lallemand Inc., Montreal, CA) de Oenococcus oeni. Esta cepa es tolerante a: pH > 3,2; etanol < 15,5 % v/v; total SO2 < 50 mg/L; temperatura > 14 °C. Tiene requerimientos nutricionales normales, buena implantación rápida cinética fermentativa y baja producción de acidez volátil y aminas biógenas.

Los inóculos se han preparado en medio MLO (Pronadisa, Madrid, España) suplementado con un 10 % de zumo de tomate a 30 °C. La población se ha estimado por DO a 600 nm y verificado por plaqueo en profundidad en medio MLO. La población inicial en el vino inoculado de 7-log UFC/mL en el ensayo de inhibición en el que se evaluaron de forma independiente el ácido fumárico y el quitosano, y de 8-log en el ensayo de inhibición en que ambos se usaron de forma conjunta.

«El ácido fumárico se ha añadido a distintas concentraciones a partir de una disolución de 10 g/L. El quitosano se ha añadido dispersado en vino.».
 

Ácido fumárico (99,0 %) (Panreac, Barcelona, España), y quitosano Bactiless™ (Lallemand Inc., Montreal). El ácido fumárico se ha añadido a distintas concentraciones a partir de una disolución de 10 g/L. El quitosano se ha añadido dispersado en vino.

La evolución del ácido málico se ha determinado por análisis enzimático. Se ha empleado un autoanalizador enzimático mod Y15 (Biosystems, Barcelona, España).

Las FML se han desarrollado en vino tinto de la de la variedad tempranillo (V. vinifera L). Sus parámetros analíticos son: etanol (%, v/v) 12, pH 3,8, azúcares residuales <2 g/L. Se ha tratado térmicamente 10 min a 110 °C. Se ha comprobado la ausencia de bacterias viables en 10 mL. Los ensayos de inhibición de la FML se han realizado en volúmenes de 60 mL. Se ha mantenido un control sin inocular que no ha desarrollado la FML.

 

Resultados y discusión

En el vino con población 7-log de Oenococcus oeni (Oo), la dosis de quitosano de 0,2 g/L es insuficiente para detener la FML; sin embargo 0,5 g/L bloquean completamente la degradación de málico (fig. 2A). La ausencia de FML se mantiene durante más de 40 días. Hay que considerar que la población que se inocula es la de una FML vigorosa en pleno desarrollo, no una población residual que pudiera existir en un vino. En cambio, cuando se añade ácido fumárico a dosis de 0,3 y 0,6 ambas inhiben (fig. 2B). Ya se ha observado el efecto inhibitorio de dosis de fumárico de 0,3 a 0,6 g/L.13 Aunque en algunos casos 0,3 puede ser insuficiente dependiendo de la dosis de inóculo, de la composición nutricional del mosto, pH y T.

 

Figura 2

Figura 2: Efecto del quitosano (Q; 0,2 y 0,5 g/L; A) y del ácido fumárico (F; 0,3 y 0,6 g/L; B) en la degradación de ácido málico durante la FML de un vino tinto inoculado con una población inicial 7-log UFC/mL.
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Para comprobar el efecto conjunto de ambos inhibidores se ha hecho un segundo experimento aplicando diversas dosis de quitosano y ácido fumárico. En este experimento la dosis inoculada inicial de Oo ha sido de 8-log UFC/mL. En las figuras 3A y B se verifica que a dosis de ácido fumárico de 0,15 g/L y de quitosano de 0,1 y 0,2 g/L, no existe inhibición de la FML y se completan entre 5 y 15 días, cuando se adicionan de forma individual y conjunta. Por tanto, estas dosis no tienen efecto inhibitorio en las condiciones y vino estudiados. Previamente se ha observado que una dosis de 0,15 g/L de ácido fumárico no tiene una concentración adecuada para detener la FML.13 Dependiendo de las condiciones retrasa, pero no produce una inhibición siquiera parcial de la FML.

Sin embargo, cuando se utilizan las mismas dosis de quitosano pero con 0,3 g/L de ácido fumárico, los tratamientos individuales no resultan inhibitorios (figs. 3C y D), aunque la dosis de 0,3 g/L ralentiza el desarrollo de la FML (figs. 3C y D). Sin embargo, ambos tratamientos conjuntos muestran un mayor efecto inhibitorio (fig. 3C) y el de 0,2 g/L de quitosano con 0,3 de fumárico detiene la FML después de 5 días (fig. 3D), mostrando un efecto sinérgico. Pese a la alta población inicial inoculada (8-log UFC/mL), la degradación de málico es solo ligeramente superior al 50% (fig. 3D).

 

Figura 3

Figura 3: Efecto conjunto del quitosano (Q; 0,1 y 0,2 g/L) y del ácido fumárico (F; 0,15 y 0,3 g/L) en la degradación de ácido málico durante la FML de un vino tinto inoculado con una población inicial 8-log UFC/mL.
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El empleo de dosis reducidas de ambos inhibidores permite retrasar y/o detener la FML al aplicar quitosano complementado con el ácido fumárico. Además, existe un efecto protector residual por el fumárico que permanece en disolución incluso post embotellado. La inhibición de la FML además incide en la reducción de metabolitos fermentativos bacterianos potencialmente tóxicos como las aminas biógenas y en la reducción de los niveles necesarios de SO2. Colateralmente, debido al efecto acidificante del ácido fumárico se aumentan los niveles de SO2 libre y molecular y se intensifica el color en vinos tintos por efecto hipercrómico.13,23 El efecto acidificante del ácido fumárico es 1,5 veces el del ácido cítrico24, y se consiguen reducciones de pH de 0,1-0,2 unidades dependiendo del efecto tampón del vino cuando se utilizan dosis de 300-600 mg/L.

La apolaridad del ácido fumárico, debido a su doble enlace, hace que se comporte como anfipático, y sea más eficiente atravesando estructuras lipídicas como la membrana celular bacteriana. Por esto es más fácil que concentraciones más altas permeen al interior celular y muestre una mayor actividad antimicrobiana que otros ácidos como el láctico. Por otra parte no es inhibitorio frente a levaduras probablemente por metabolizarse intracelularmente.

 

Consideraciones finales

Quitosano y ácido fumárico son dos aditivos inocuos, que permiten controlar el desarrollo de bacterias lácticas y estabilizar los vinos frente a la FML. Su uso simultáneo tiene efectos complementarios y ligeramente sinérgicos. Constituyen una alternativa interesante y más eficaz que la lisozima para evitar pérdidas de acidez y frescura en los vinos por desarrollo indeseado de la FML. El ácido fumárico además tiene un ligero efecto acidificante a las dosis que se recomiendan como inhibidor de la FML. Dosis de hasta 600 mg/L de ácido fumárico son difíciles de detectar sensorialmente.

 

Agradecimientos

Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades project: [RTI2018-096626-B-I00]; European Regional Development Fund (ERDF) [FEDER INTERCONECTA EXP-00111498/ITC-20181125]- Proyecto FRESHWINES.

 

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